簡介

神經(jīng)突增生是體外研究神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)元變性的常用檢測。神經(jīng)突的發(fā)展需要胞外和胞內(nèi)信號(hào)的復(fù)雜相互作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子可以刺激或抑制神經(jīng)突的生長。重要的是，神經(jīng)元的發(fā)育會(huì)受到神經(jīng)毒性化學(xué)物質(zhì)的影響。

我們在 ImageXpress Pico 自動(dòng)化細(xì)胞成像系統(tǒng)上評(píng)估了神經(jīng)軸突生長檢測，以測定化合物對(duì)發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響的能力。選擇該測定法是因?yàn)槠渥鳛樯窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的關(guān)鍵過程，神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中擴(kuò)展其神經(jīng)突以形成完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)?？偵窠?jīng)突增生通常是報(bào)告的最常見指標(biāo)，而總分支和總過程等其他參數(shù)可能代表化合物可能抑制神經(jīng)突增生的其他模式。

我們評(píng)估了化合物對(duì)神經(jīng)突生長的特異性影響，包括通過多重測量定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的范圍和復(fù)雜性。使用多次測量表征神經(jīng)突生長的表型讀數(shù)。神經(jīng)突增生的特征是生長程度（每個(gè)細(xì)胞的總生長長度或平均生長）、神經(jīng)突進(jìn)程數(shù)（進(jìn)程總數(shù)）和分支程度（每個(gè)細(xì)胞的總分支數(shù)和平均分支數(shù)）。

優(yōu)勢

• 評(píng)估化合物對(duì)神經(jīng)突生長的特異性影響

• 通過多重測量定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的范圍和復(fù)雜性

•  利用檢測來研究體外神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)元變性

Materials

• iPSC 源性神經(jīng)元（人神經(jīng)元試劑盒、NEURO KIT、XK-001-1V、XCell Science Company）

•  Poly-D-lysine 預(yù)包被 384 孔板（Corning Biocoat）

• 層粘連蛋白 （Sigma-Aldrich）

•  Hoechst （ThermoFisher Scientific）

•  Hank 的平衡鹽溶液（Life Technologies）

• ImageXpress Pico 自動(dòng)化細(xì)胞成像系統(tǒng) （Molecular Devices）

• CellReporterXpress® 圖像采集和分析軟件（Molecular Devices）

方法

將 iPSC 源性神經(jīng)元接種在經(jīng) 3.3 mg/mL 層粘連蛋白處理的聚-D-賴氨酸預(yù)包被 384 孔板上。每孔接種一萬個(gè)細(xì)胞，并在化合物處理前在 iCell Neuron 維護(hù)培養(yǎng)基中維持 48 小時(shí)。這些細(xì)胞中的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)通常在接種后 2 小時(shí)開始形成，并且在培養(yǎng)中復(fù)雜性增加長達(dá) 10-12 天。按照制造商的建議，將神經(jīng)元培養(yǎng) 14 天，然后在384 孔板中的 6 點(diǎn)濃度范圍 （0.3-100 uM）。通過量化每孔的總生長、分支、過程和活細(xì)胞數(shù)量來評(píng)估對(duì)神經(jīng)突生長的影響。使用 EC50值評(píng)估濃度-反應(yīng)依賴性。

將細(xì)胞在 37°C 和 5% CO2 下暴露于化合物中72小時(shí)。接下來，取出培養(yǎng)基，用 4% 甲醛固定細(xì)胞，洗滌 2 次，然后用 1：100 的 AF-488 結(jié)合鬼筆環(huán)肽和 1 um Hoechst 33342 在無菌 Hank’s 平衡鹽溶液中孵育 2 小時(shí)。Calcein AM 被用作神經(jīng)突增生和細(xì)胞活性的標(biāo)記物。孵育后，用含 0.1% 胎牛血清 （FBS） 的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 代替染色溶液，以進(jìn)行圖像采集。

使用 10X 物鏡，使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)采集單個(gè)孔的圖像。通常，在 384 孔板中，每個(gè)孔捕獲一個(gè) 10X 圖像。10X物鏡可提供足夠的分辨率，以區(qū)分每張圖像中相對(duì)大量的細(xì)胞 （>200） 中的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，約占孔總面積的 1/6。使用 CellReporterXpress 軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，該軟件包含用于神經(jīng)突追蹤的分析模塊。圖 1 顯示了來自 DMSO 處理的神經(jīng)元的代表性放大圖像，該神經(jīng)元具有神經(jīng)突追蹤疊加。

圖 1：使用 &-微管蛋白（綠色）染色和 CellReporterXpress 軟件分析軌跡顯示的對(duì)照和化合物處理細(xì)胞的神經(jīng)元代表性圖像。XCell 神經(jīng)元用化合物處理三天，然后固定并用 AF488-conJugated anti-&-tubulin （TUJ-1） 抗體 （1：100） 染色。ImageXpress Pico 系統(tǒng)使用 10X Plan Fluor 物鏡以及 FITC 和 DAPI 通道拍攝圖像。使用神經(jīng)突追蹤分析方案處理圖像。分析掩膜顯示生長（綠色）、細(xì)胞體（藍(lán)色）和分支點(diǎn)（粉色）。

結(jié)果

我們觀察到化合物處理后神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)形成呈劑量依賴性抑制（圖 2）。對(duì)這些實(shí)驗(yàn)中捕獲的圖像進(jìn)行定量分析，包括推導(dǎo)多個(gè)參數(shù)，以便評(píng)估培養(yǎng)神經(jīng)元的形態(tài)特征以及神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性程度和程度。還定量了圖像中總細(xì)胞體的數(shù)量，以估計(jì)化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞鋪板和神經(jīng)突生長非常一致且一致，因此我們使用每張圖像的神經(jīng)元總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)細(xì)胞生長的長度或每個(gè)細(xì)胞的過程或分支也被測量，但由于冗余，因此不用于統(tǒng)計(jì)分析。化合物的毒性效應(yīng)可通過 EC5 值（50% 神經(jīng)突生長抑制的化合物濃度）進(jìn)行比較，該值源自神經(jīng)突生長的 4 參數(shù)曲線擬合、分支數(shù)量、工藝或活細(xì)胞數(shù)量。圖 2 顯示了各種化合物（1 uM 濃度）中神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)總長度（總生長）的濃度依賴性曲線，以評(píng)估其潛在的神經(jīng)毒性作用并優(yōu)先考慮進(jìn)一步的毒性評(píng)估。圖 3 和 4 顯示了在 10 uM 濃度下測試的神經(jīng)毒性化合物。

圖 2. 對(duì)于用 1 AM 指示化合物處理的神經(jīng)元，測量神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)的破壞。EC50 值由總生長減少、羅登酮為 6 pM、甲基汞為 0.07 pM 來定義。定義分支點(diǎn)減少的 EC50 值，羅登酮為 3 pM，甲基汞為 0.07 pM

圖 3. 在 10 pM 濃度下測試的神經(jīng)毒性化合物的圖像。

圖 4. 在 10 pM 濃度下測試的神經(jīng)毒性化合物的平均神經(jīng)突生長。

結(jié)論

該檢測可用于研究神經(jīng)突增生的不同調(diào)節(jié)劑以及體外神經(jīng)毒性效應(yīng)。