簡(jiǎn)介

為了表現(xiàn)生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，化合物篩選細(xì)胞模型已變得更加復(fù)雜?；罴?xì)胞成像和三維模型可提供對(duì)活細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞過(guò)程的寶貴見(jiàn)解。最近，在開(kāi)發(fā)代表肝臟1、胰腺2、神經(jīng)元3和心臟組織4等不同類型人體組織的復(fù)雜類器官模型方面取得了巨大進(jìn)展。心臟細(xì)胞球可在體外收縮，并對(duì)不同調(diào)節(jié)劑的作用作出反應(yīng)。在此，我們描述了一種包括成像和分析方案的方法，該方法可用于體外監(jiān)測(cè)和表征心臟細(xì)胞球的搏動(dòng)模式。

在心臟毒性研究中，能夠查看搏動(dòng)心肌細(xì)胞的實(shí)時(shí)行為，使科學(xué)家能夠通過(guò)使用透射光、相差和熒光成像從單次檢測(cè)中收集多參數(shù)結(jié)果。在藥物開(kāi)發(fā)的早期階段篩查化合物心臟毒性可大大降低因不良心血管影響而導(dǎo)致的晚期藥物失敗相關(guān)的成本。這已促成開(kāi)發(fā)生物相關(guān)、高通量和高內(nèi)涵篩選工具，如心肌細(xì)胞球。

高內(nèi)涵篩選檢測(cè)可產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，且需要快速和自動(dòng)分析。SoftMax® Pro 導(dǎo)入功能允許您分析任何科學(xué)來(lái)源的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，包括高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（圖 1）。通過(guò)將基于圖像的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SoftMax Pro 軟件，我們能夠說(shuō)明和量化一組心臟毒性化合物處理的心肌細(xì)胞球的跳動(dòng)模式。

優(yōu)勢(shì)

分析基于圖像實(shí)驗(yàn)的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)

使用 SoftMax Pro Peak Pro 分析算法快速定量心肌細(xì)胞的搏動(dòng)模式

導(dǎo)入從任何科學(xué)儀器采集的原始數(shù)據(jù)，以便使用一個(gè)軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析

材料和方法

將細(xì)胞球大鼠心肌微組織（瑞士 InSphero AG）在 96 孔 GravityTRAP （InSphero AG） 檢測(cè)板中培養(yǎng)。在添加 DMSO、0.1 µM 異丙腎上腺素、0.1 µM 普萘洛爾、1 µM 維拉帕米、1 µM 西沙必利或 1 µM 利*卡因 30 分鐘之前，用鈣染料（EarlyTox 心臟毒性試劑盒，# R8210，Molecular Devices處理細(xì)胞球兩小時(shí)。

使用 ImageXpress® Micro XLS 系統(tǒng)以 10 倍物鏡每秒十次延時(shí)成像，共 300 個(gè)時(shí)間點(diǎn)。該系統(tǒng)是一種寬場(chǎng)自動(dòng)化 （1x-100x） 顯微鏡，能夠?qū)潭ɑ蚧罴?xì)胞檢測(cè)、組織和小生物進(jìn)行熒光、透射光和相差成像。

使用 MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件對(duì)延時(shí)圖像進(jìn)行定量，以測(cè)量熒光強(qiáng)度 （FI）。動(dòng)力學(xué) FI 值被導(dǎo)出到 Microsoft Excel 中，排列到基于 Excel 的導(dǎo)入模板中，并導(dǎo)入到 SoftMax Pro v6.4.2 中。使用預(yù)先編寫(xiě)的心肌細(xì)胞跳動(dòng) i3（高級(jí)）方案分析數(shù)據(jù)，以自動(dòng)計(jì)算十四個(gè)峰值屬性：峰值計(jì)數(shù)、峰值頻率、峰值振幅、平均峰值寬度和標(biāo)準(zhǔn)差、平均峰值上升時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)差、平均峰值衰減時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)差、平均峰值間隔和標(biāo)準(zhǔn)差、平均峰值底部寬度和標(biāo)準(zhǔn)差以及峰值規(guī)律性。

圖 2. 心肌細(xì)胞球延時(shí)圖像。 該圖像序列顯示對(duì)照大鼠心肌細(xì)胞球 （InSphero AG） 的一次搏動(dòng)，這與細(xì)胞質(zhì)鈣的增加相對(duì)應(yīng)，表現(xiàn)為鈣敏感染料的熒光信號(hào)增加。

結(jié)果

在本研究中，使用一組心臟毒性化合物處理來(lái)自 InSphero 的搏動(dòng)細(xì)胞球大鼠心肌微組織，并使用 EarlyTox 心臟毒性試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒含有鈣敏感染料，該染料經(jīng)優(yōu)化可測(cè)定與心肌細(xì)胞收縮相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)鈣濃度變化。使用 ImageXpress Micro XLS 系統(tǒng)拍攝經(jīng)處理的心肌細(xì)胞球的延時(shí)圖像，以觀察搏動(dòng)行為（圖 2）。通過(guò)基于 Excel 的導(dǎo)入功能模板將所得熒光強(qiáng)度振蕩導(dǎo)入 SoftMax Pro v6.4.2，以定量峰值參數(shù)和化合物對(duì)心臟搏動(dòng)的影響（圖 3a）。與對(duì)照組相比，異丙腎上腺素處理的心肌細(xì)胞球的搏動(dòng)頻率增加，而普萘洛爾、西沙必利和利多*因處理的心肌細(xì)胞球的搏動(dòng)頻率降低。除了降低搏動(dòng)頻率外，西沙必利處理還破壞了心肌細(xì)胞球的搏動(dòng)模式。用鈣通道阻滯劑維拉帕米處理心肌細(xì)胞球可抑制鈣信號(hào)（圖 3b 和 4）。綜上所述，結(jié)果與之前的研究一致5，6。

圖 3. Peak Pro 分析算法。（A） Peak Pro 分析算法允許自動(dòng)計(jì)算峰值參數(shù)，包括峰值頻率、計(jì)數(shù)、振幅、寬度（在10% 和 50%的 高度）以及間距、上升時(shí)間、衰減時(shí)間和不規(guī)則間距。（B） 使用心肌細(xì)胞跳動(dòng) i3（高級(jí)）程序在 SoftMax Pro 軟件中顯示計(jì)算出的峰值屬性，。

圖 4. 心肌細(xì)胞球搏動(dòng)模式。 在 SoftMax Pro 軟件中，對(duì)照 （DMSO） 和處理過(guò)的心肌細(xì)胞球的搏動(dòng)模式在 30 秒的時(shí)間段內(nèi)以熒光強(qiáng)度圖直觀表示。頂部：對(duì)照（左）和維拉帕米（右）。中間： 普萘洛爾（左）和西沙必利（右）。底部：異丙腎上腺素（左）和利*卡因（右）。

結(jié)論

使用生物相關(guān)、基于細(xì)胞的模型進(jìn)行高內(nèi)涵和高通量心臟毒性篩選檢測(cè)，從而在開(kāi)發(fā)的早期階段消除心臟毒性候選藥物，可大大減少藥物開(kāi)發(fā)的時(shí)間和成本。為了保持高通量和高內(nèi)涵篩選檢測(cè)的效率，需要同樣快速的數(shù)據(jù)分析。SoftMax Pro 導(dǎo)入功能可用于 SoftMax Pro v6.4.1 或更高版本，可實(shí)現(xiàn)從成像系統(tǒng)、實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)、非 Molecular Devices 讀板機(jī)、閃爍計(jì)數(shù)器等各種科學(xué)儀器采集的微孔板格式數(shù)值數(shù)據(jù)分析?；?/span> Excel 和 XML 的兩種導(dǎo)入選項(xiàng)可提供從手動(dòng)導(dǎo)入到全自動(dòng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入和分析的一系列自動(dòng)化功能。除了專門(mén)用于量化心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞球跳動(dòng)等多峰振蕩數(shù)據(jù)的 Peak Pro 軟件算法和方案外，SoftMax Pro 的公式系統(tǒng)和語(yǔ)法助手還可幫助您獲得所需的結(jié)果，包括 IC50 圖和條件通過(guò)/失敗結(jié)果?？杀４孀远x操作規(guī)程以供重復(fù)使用，無(wú)論數(shù)據(jù)源如何，均可確保高效且一致的分析。

參考文獻(xiàn)

1.       Kermanizadeh A、Lohr M、Roursgaard M 等人 使用一種新型原代人 3D 肝臟微組織模型單次和多次暴露工程納米材料后的肝臟毒理學(xué)。顆粒和纖維毒理學(xué)。2014; 11:56.

2.       Zuellig RA、Cavallari G、Gerber P、Tschopp O、Spinas GA、Moritz W 和 Lehmann

R. 改進(jìn)了重力增強(qiáng)的大鼠和人胰腺假胰島的生理特性。組織工程與再生醫(yī)學(xué)雜志. 2014 doi： 10.1002/term.1891

3.       Kraus D、Boyle V、Leibig N、Stark GB 和 Penna V 神經(jīng)細(xì)胞球 - 一種用于周圍神經(jīng)再生的新型 3D 體外模型。神經(jīng)科學(xué)方法雜志。2015; 246:97-105.

4.       Zuppinger C、Agarkova I、Moritz W 和 Kelm J。心臟毒性檢測(cè)的人 3D 心肌微組織模型。海報(bào)展示于：EUROTOX 2013。第 49 屆歐洲毒理學(xué)協(xié)會(huì)大會(huì)。2013 年 9 月 1-4 日；瑞士茵特拉肯。

5.       Sirenko O、Cromwell EF、Crittenden C、Wignall JA、Wright FA 和 Rusyn I。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中跳動(dòng)參數(shù)的評(píng)估可實(shí)現(xiàn)體外心臟毒性定量篩選。毒理學(xué)和應(yīng)用藥理學(xué)。2013; 273(3):500-507.

6.       Sirenko O、Crittenden C、Calamaras N、Hesley J、Chen YW、Funes C、Rusyn I、Anson B 和 Cromwell EF。使用 iPSC 細(xì)胞對(duì)化合物對(duì)心肌細(xì)胞生理學(xué)的影響進(jìn)行多參數(shù)體外評(píng)估。生物分子篩選雜志。2013; 18:39-53.