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技術(shù)文章

休止細胞制備少不了離心機

閱讀:811          發(fā)布時間:2022-8-12
休止細胞制備少不了離心機
  休止細胞制備少不了離心機。
  休止細胞反應(yīng)又稱靜息細胞,把培養(yǎng)液中各種營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)一段時間,以消耗內(nèi)源營養(yǎng)物質(zhì),呈呈饑餓狀態(tài)的細胞,在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應(yīng)用。它的主要特性就是細胞雖然處于休眠狀態(tài),不進行生長繁殖,但仍含有各種險系,其有氧化和發(fā)酵能力,在適宜條件下可再恢復(fù)生長。另外休止細胞反應(yīng)專一性強,可以提高底物轉(zhuǎn)化率,不易染雜菌,可以減少產(chǎn)物對菌體生長及醇合成的抑制。
  培養(yǎng)基的制備及滅菌:
  按實驗材料中的培養(yǎng)基種類和數(shù)量配置相應(yīng)培養(yǎng)基,進行滅菌。
  菌種活化和擴大化培養(yǎng)
  將E.coli cVcc249保藏菌種轉(zhuǎn)接到試管*固體培養(yǎng)基斜面,37℃下培養(yǎng)18~24h.
  選取長勢良好的活化菌種轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)16~18h。
  休止細胞的制備將三角瓶中的菌體倒入離心管中,4000rpm離心機離心15min,收集沉淀。
  85%生理鹽水洗滌沉淀三次,每次4000rpm離心機離心15min。
  用pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)20mL(用量根據(jù)使菌體數(shù)量而定)制備菌懸液,將制成的菌懸液放入4℃冰箱培養(yǎng)72hr,以降低內(nèi)呼吸,制得休止細胞。
  底物的配制:
  分別配制濃度為0.1M的四種底物:乙酸鈉、琥珀酸鈉、α -酮戊二酸鈉和檸檬酸鈉。按照需要進行不同濃度梯度的稀釋。
  酶與底物反應(yīng):
  在5mL的離心管中,加入0.4ml的休止細胞和0.4ml底物,37℃恒溫30min;加入40ul噻唑鹽,振蕩混勻,在37℃下反應(yīng).2hr;反應(yīng)完后,再離心管中加入1.5mL的二甲亞礬,混勻振蕩,并在37℃恒溫箱中保溫 30min;加入蒸餾水1.5ml。
  測定OD510值:
  按照分光光度計的使用說明,測定各個樣品的ODs1o值,并做好實驗記錄。
  整個實驗過程中一定要無菌操作,尤其是活化菌株時,因為所用的培養(yǎng)基為*培養(yǎng)基,一般的微生物也能生長,為確保所測得的脫氫酶活性是來自于保藏菌種的,所以第一步活化菌種時一定要確保無菌操作。
  嚷唑鹽必須避光保存,因其見光易分解。另外,由于噻唑鹽和二甲基亞礬都有毒性,再加入這兩種試劑時,需戴手套進行操作。
  休止細胞反應(yīng)實驗操作在洗滌細胞時,每次懸浮務(wù)必充分,否則容易造成洗滌不干凈,導(dǎo)致有殘存的營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致休止細胞的質(zhì)量不好。
  在用分光光度計測量其OD值時,由于本實驗中所用的分光光度計適合的測量范圍在0.2~0.7中,在測量前需檢測下樣品的OD值是否在這個范圍內(nèi),如果過高,則加適量PBS稀釋。另外,在測量前,樣品需充分混勻,且動作要快,以免甲瓚又結(jié)晶出來,影響測量的結(jié)果??瞻讓φ諡檎麴s水。


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