高效液相色譜儀的用法用途介紹

一、HPLC 的核心原理：“分配差異" 實(shí)現(xiàn)分離

1. 兩相作用：

• 流動(dòng)相：由單一溶劑或混合溶劑組成（如甲醇 - 水、乙腈 - 水），在高壓泵驅(qū)動(dòng)下以穩(wěn)定流速（0.1-5mL/min）流經(jīng)色譜柱；

• 固定相：色譜柱內(nèi)的填充物（如 C18 反相柱、硅膠正相柱），不同物質(zhì)與固定相的 “吸附 / 溶解能力" 不同（即分配系數(shù)差異）。

2. 分離過程：

   樣品（如混合溶液）經(jīng)進(jìn)樣器注入流動(dòng)相后，隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱 —— 與固定相親和力弱的物質(zhì)，在柱內(nèi)停留時(shí)間短，先流出色譜柱；與固定相親和力強(qiáng)的物質(zhì)，停留時(shí)間長，后流出色譜柱，最終實(shí)現(xiàn) “不同組分的時(shí)間差分離"。

3. 檢測與定量：

   分離后的組分依次進(jìn)入檢測器（如紫外檢測器、熒光檢測器），檢測器將 “組分濃度信號(hào)" 轉(zhuǎn)化為 “電信號(hào)"，經(jīng)工作站處理后生成 “色譜圖"（橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，用于定性；縱坐標(biāo)為峰面積 / 峰高，用于定量）。

二、HPLC 的基本用法：標(biāo)準(zhǔn)操作流程（以 “藥品中雜質(zhì)檢測" 為例）

1. 前期準(zhǔn)備：物料與設(shè)備檢查

• 流動(dòng)相制備：

  根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法（如藥典標(biāo)準(zhǔn)）配制流動(dòng)相，需滿足 “純度要求"和 “比例精度"；若流動(dòng)相含緩沖鹽，需用 0.45μm 濾膜過濾，并超聲脫氣 15-20 分鐘（去除氣泡，防止檢測器基線波動(dòng)）。

• 色譜柱選擇與安裝：

  根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適色譜柱（如檢測極性物質(zhì)用 C18 反相柱，檢測非極性物質(zhì)用硅膠正相柱）；安裝時(shí)確保色譜柱方向正確（柱身上標(biāo)注 “流向"，從進(jìn)樣端指向檢測端），接頭擰緊（避免漏液，可用扳手輕輕擰至 “無液體滲出" 即可，過度用力會(huì)損壞螺紋）。

• 設(shè)備狀態(tài)檢查：

  打開 HPLC 主機(jī)電源，檢查各模塊（高壓泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器）指示燈是否正常；啟動(dòng)工作站（如 Empower、ChemStation），連接設(shè)備并確認(rèn) “通訊正常"；檢查檢測器氘燈 / 鎢燈壽命（若剩余壽命不足 100 小時(shí)，需提前更換）。

2. 系統(tǒng)啟動(dòng)與平衡：確保分離穩(wěn)定性

• 設(shè)定參數(shù)：

  在工作站中設(shè)置關(guān)鍵參數(shù)：

• 流動(dòng)相流速（如 1.0mL/min，根據(jù)色譜柱規(guī)格調(diào)整，4.6mm 內(nèi)徑柱常用 1.0mL/min）；

• 柱溫（如 30℃，柱溫箱可控制溫度波動(dòng) ±0.1℃，穩(wěn)定保留時(shí)間）；

• 檢測器波長（如 254nm，根據(jù)樣品最大吸收波長設(shè)定，可通過 “光譜掃描" 確定最佳波長）；

• 進(jìn)樣量（如 10μL，根據(jù)樣品濃度調(diào)整，濃度高則減少進(jìn)樣量，避免檢測器過載）。

• 系統(tǒng)平衡：

  啟動(dòng)高壓泵，讓流動(dòng)相以設(shè)定流速流經(jīng)色譜柱，同時(shí)開啟檢測器，觀察 “基線穩(wěn)定性"—— 當(dāng)基線波動(dòng)≤0.1mAU（毫吸光度單位）且持續(xù) 15-30 分鐘無漂移時(shí)，說明系統(tǒng)已平衡（平衡不充分會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間波動(dòng)、峰形異常）。

3. 樣品分析：標(biāo)準(zhǔn)品與樣品進(jìn)樣

• 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣（繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）：

  配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（如 0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL），按濃度從低到高依次進(jìn)樣；每針進(jìn)樣后，記錄標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間（定性依據(jù)）和峰面積（定量依據(jù)）；用峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（要求相關(guān)系數(shù) R2≥0.999，確保定量準(zhǔn)確性）。

• 樣品進(jìn)樣與檢測：

  將待分析樣品經(jīng)前處理（如過濾、萃取、稀釋，去除基質(zhì)干擾）后，注入進(jìn)樣器；進(jìn)樣時(shí)需 “排氣泡"（用樣品溶液沖洗進(jìn)樣針 3-5 次，避免空氣進(jìn)入色譜柱）；樣品經(jīng)色譜柱分離后，檢測器記錄色譜圖，工作站自動(dòng)計(jì)算樣品中目標(biāo)組分的保留時(shí)間（與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，確認(rèn)是否為目標(biāo)物質(zhì)）和峰面積（代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度）。

4. 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定

• 數(shù)據(jù)處理：

  檢查色譜圖峰形（要求峰形對(duì)稱，拖尾因子 0.9-1.1，分離度≥1.5，否則需調(diào)整流動(dòng)相比例或柱溫）；通過工作站計(jì)算 “含量"（如藥品中有效成分含量 =（樣品峰面積 × 標(biāo)準(zhǔn)品濃度）/（標(biāo)準(zhǔn)品峰面積 × 樣品稀釋倍數(shù)））；輸出報(bào)告（包含標(biāo)準(zhǔn)曲線、色譜圖、計(jì)算結(jié)果）。

• 結(jié)果判定：

  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求判定結(jié)果（如藥品雜質(zhì)含量≤0.1% 為合格，超過則判定為不合格）。

5. 后期維護(hù)：延長設(shè)備壽命

• 系統(tǒng)沖洗：

  分析結(jié)束后，需用 “過渡溶劑" 沖洗色譜柱；若長期不用，需將色譜柱保存在合適溶劑中（如 C18 柱保存在純甲醇中）。

• 設(shè)備清潔：

  擦拭進(jìn)樣器針頭（避免樣品殘留），清理廢液瓶（防止廢液溢出腐蝕設(shè)備）；關(guān)閉檢測器氘燈（延長壽命），最后關(guān)閉主機(jī)電源。

三、HPLC 的主要用途：覆蓋多領(lǐng)域的分析需求

1. 醫(yī)藥領(lǐng)域：藥品質(zhì)量控制與研發(fā)（最核心應(yīng)用場景）

• 藥品有效成分含量測定：如檢測阿司匹林片中阿司匹林的含量（依據(jù)《中國藥典》方法，用 C18 柱，流動(dòng)相為乙腈 - 0.1% 磷酸水，紫外檢測器 280nm），確保藥品含量符合標(biāo)準(zhǔn)（如標(biāo)示量的 95%-105%）；

• 雜質(zhì)：藥品中微量雜質(zhì)（如降解產(chǎn)物、合成副產(chǎn)物）可能具有毒性，需用 HPLC 檢測（如青霉素中的青霉素聚合物，用凝膠色譜柱分離，避免過敏反應(yīng)）；

• 藥物研發(fā)：在新藥研發(fā)中，用于 “藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析"（監(jiān)測藥物在動(dòng)物體內(nèi)的濃度變化）、“制劑穩(wěn)定性研究"（跟蹤藥物長期儲(chǔ)存后的含量變化）。

2. 食品領(lǐng)域：食品安全檢測與品質(zhì)監(jiān)控

• 食品添加劑檢測：如檢測飲料中的防腐劑（山梨酸鉀、苯甲酸鈉）、甜味劑（三氯蔗糖、阿斯巴甜），確保含量不超過國家標(biāo)準(zhǔn)

• 污染物檢測：如檢測食用油中的苯并 [a] 芘（強(qiáng)致癌物，用熒光檢測器，檢出限可達(dá) 0.1μg/kg）、果蔬中的農(nóng)藥殘留

• 營養(yǎng)成分分析：如檢測牛奶中的維生素（維生素 A、D，用反相柱，紫外或熒光檢測器）、谷物中的黃酮類化合物（功能性成分，評(píng)估營養(yǎng)價(jià)值）。

3. 環(huán)境領(lǐng)域：環(huán)境污染物監(jiān)測

• 水體污染物檢測：如檢測地表水中的酚類化合物）、多環(huán)芳烴（苯并 [a] 芘），評(píng)估水質(zhì)安全；

• 土壤與沉積物分析：如檢測工業(yè)場地土壤中的鄰苯二甲酸酯（增塑劑，用 C18 柱，紫外檢測器 224nm），判斷土壤污染程度；

• 離子檢測（離子色譜模式）：搭配離子色譜柱和電導(dǎo)檢測器，檢測飲用水中的氟離子、硝酸根、硫酸根，預(yù)警水體富營養(yǎng)化或氟超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)。

4. 化工與材料領(lǐng)域：產(chǎn)品純度與成分分析

• 化工產(chǎn)品純度檢測：如檢測染料中的主成分含量（確保染色效果一致）、聚合物中的單體殘留（如聚乙烯中的乙烯單體，避免毒性殘留）；

• 材料成分分析：如檢測鋰電池電解液中的添加劑（如碳酸乙烯酯，用正相柱分離），評(píng)估電池性能；

  
  

四、HPLC 的核心優(yōu)勢

• 核心優(yōu)勢：

1. 適用范圍廣：可分析 80% 以上的有機(jī)化合物（包括熱不穩(wěn)定、高沸點(diǎn)、強(qiáng)極性物質(zhì)）；

2. 靈敏度高：常規(guī)紫外檢測器檢出限可達(dá) μg/L 級(jí)，搭配質(zhì)譜檢測器（HPLC-MS/MS）可達(dá) ng/L 級(jí)；

3. 分離效率高：一根色譜柱可同時(shí)分離數(shù)十種組分（如同時(shí)檢測食品中 10 種農(nóng)藥殘留）；

   定量準(zhǔn)確：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，定量可控制在 ±5% 以內(nèi)，滿足精密分析需求。

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總結(jié)

高效液相色譜儀是 “分離與分析領(lǐng)域的萬能工具"，其用法圍繞 “系統(tǒng)平衡→標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)→樣品檢測→數(shù)據(jù)處理" 的標(biāo)準(zhǔn)化流程，核心是通過 “參數(shù)優(yōu)化" 實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分的高效分離與準(zhǔn)確定量；用途覆蓋醫(yī)藥、食品、環(huán)境、化工等關(guān)鍵領(lǐng)域，直接支撐 “質(zhì)量控制、安全檢測、研發(fā)創(chuàng)新" 等核心需求。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室而言，HPLC 的熟練操作與應(yīng)用，是保障分析數(shù)據(jù)可靠、滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵。

高效液相色譜儀在環(huán)境監(jiān)測行業(yè)中到底有什么應(yīng)用呢？