熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測

一、實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。

二、實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代

1. 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，評估細(xì)胞匯合的程度以及確認(rèn)無細(xì)菌和真菌污染；
2. 移去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液；
3. 加入相當(dāng)于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細(xì)胞，一般三次即可；
4. 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%胰酶消化單層細(xì)胞。搖晃培養(yǎng)皿（瓶）使其胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞單層，倒出多余的胰蛋白酶；
5. 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱，放置2-10 min；
6. 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞以確保所有細(xì)胞都分離且漂浮，輕拍培養(yǎng)皿（瓶）的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細(xì)胞；
7. 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以滅活胰蛋白酶，取出100-200μl用于計(jì)數(shù)；
8. 將所需數(shù)量的細(xì)胞移至一個(gè)新標(biāo)記好的溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（瓶）中；選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞系；
9. 按照細(xì)胞系的生長特性重復(fù)該步驟，直到胞狀態(tài)良好、無污染，可以鋪板使用，其余選擇凍存。

2.活細(xì)胞計(jì)數(shù)

1. 取一瓶傳代的細(xì)胞，待長成單層以后使用；細(xì)胞懸液的制備方法：用0.25%的胰酶消化、PBS洗滌后，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細(xì)胞懸液。
2. 蓋好蓋玻片，取一套血球計(jì)數(shù)槽，制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液到離心管中，加入等體積臺盼藍(lán)染液，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，不考慮細(xì)胞的活力，則可不使用臺盼藍(lán)染色。
3. 將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板，注意蓋玻片下不要有氣泡，也不要懸液流入旁邊槽中。
4. 統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)，將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的大格（每格含有16個(gè)中格）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
5. 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

6）（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml = (四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4）×2×10⁴

3.細(xì)胞處理

4.RNA提取

1）細(xì)胞中加入1ml Trizol，將細(xì)胞裂解吸到一個(gè)1.5ml的EP管中；

2）加入200ul氯.仿，輕輕顛倒數(shù)次混勻，室溫放置5分鐘；

3）12000rpm，4℃15min 4℃；

4）轉(zhuǎn)上層水相（約400ul）于新1.5ml EP管中，加入400ul異丙醇，混勻，室溫靜置10min；；

5）12000rpm 10min 4℃；

6）棄上清，沉淀用預(yù)冷的70%無水乙醇洗3次，空氣干燥5-10分鐘，溶于20ulDEPC水中；

7）分光光度計(jì)測定RNA濃度。

5.RNA cDNA第.一鏈合成

1. 將逆轉(zhuǎn)所需要的物品準(zhǔn)備好，RNA濃度計(jì)算好，tube準(zhǔn)備并標(biāo)記上；
2. 在冰浴的nuclease-free PCR管中加入試劑
3. 輕輕混勻，42度孵育15分鐘。
4. 85度加熱5秒失活TransScript RT/RI和gDNA Remover。
5. 將上述溶液-20°C保存。

6.熒光定量PCR檢測

1. 將cDNA樣品稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測。
2. 配制反應(yīng)混合液
3. PCR循環(huán)條件
4. 儀器的操作

完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。