WB如何快速蛋白定量（Bradford 法）

上期談到了“蛋白質(zhì)濃度測定常用的三種方法”，今天繼續(xù)就這話題詳解另一種蛋白定量的方法--Bradford 法，至于選用哪種方法，可以根據(jù)實驗室的條件和個人喜好來選！做實驗前我們先了解一下實驗原理，如下：

BCA法實驗原理：堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+結(jié)合生成紫色絡(luò)合物，同時將Cu2+還原為Cu+。BCA試劑可靈敏特異的與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的絡(luò)合物，562nm處有高的吸收值，可在540-595nm測定其吸收值，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

Bradford 法實驗原理：考馬斯亮藍G250,在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量。

快速測蛋白法

要想加快速度好是選用 Bradford 法了，這是為什么呢？看Abbkine蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）優(yōu)點就知道了：

" 節(jié)省時間—顯色反應(yīng)迅速

" 兼容性好—不受大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的影響。對于樣品中巰基乙醇和二硫蘇糖醇的兼容濃度，分別可達1mM和5mM。

" 良好的檢測范圍—檢測范圍為50 - 1000ug/ml。

下圖就是用 Bradford 法測出的標準曲線。雖然線性擬合不佳，但是二項式吻合度卻非常高，可以說非常了。

下圖展示了如何在 excel 中制作二項式標準曲線。

到此為止，前面我們擔心的幾個問題就已經(jīng)全部解決了。，擔心 Triton 或 SDS 的影響，我們用去垢劑兼容性的 Bradford 試劑即可。第二，擔心標準曲線不佳，我們用二項式來擬合即可。

下面我們繼續(xù)利用 excel 的自動化功能進一步提升計算速度。首先，初中的時候大家就學(xué)過，解二項式的公式是：

這條曲線是一條開口向下的拋物線，所以取 x 軸上的較小的值就是我們所要的濃度值。為了簡單易用，我們可以先命名幾個單元格為 background，a，b，c，從酶標儀讀取 OD 值之后填入 background，復(fù)制標準曲線的光密度值，填入 excel 給出的方程中的 a，b，c 之后，excel 就能自動減去背景計算出濃度了。

整個過程熟練的話 1 分鐘足矣，操作的同學(xué) 2 分鐘也就足夠了。俗話說好馬配好鞍，快速 WB 需得配合快速蛋白定量方能有一氣呵成、唯快不破的痛快淋漓。但是，使用這種方法需要注意的幾個問題：

注意要點

1. 蛋白濃度不能太高，如果超過了標準曲線的范圍（比如 OD>2），那就測量不準了。不僅是本方法，所有基于濃度標準曲線的方法都是如此，比如 ELISA。當然也不能太低了。

2. 大約 10 年前就有文獻報道測量雙波長，即 A595 和 A450 的比值能夠獲得良好的線性關(guān)系并提高靈敏度，這種方法我試過了，在 0.125-1.5 mg/ml 的范圍內(nèi)準確性不如二項式曲線擬合高。

3. 另外，標準品有可能發(fā)生降解導(dǎo)致濃度不準確，建議每次測量時加入一個已知濃度的樣本作為校驗。我每次都會加入一個 0.1-0.5 mg/ml 的 BSA 標準品，校驗一下曲線是否準確。

4.加入標準品的時候槍頭一定不能有殘留，否則容易引起較大誤差，建議初學(xué)者剛開始時做 2 到 3 個標準品復(fù)孔。

5.Bradford 法加完樣之后需立刻馬上測量，OD 值能穩(wěn)定保持 10 分鐘左右，如果不能馬上測量，建議換用 BCA 法。

6. 大招：如果你已經(jīng)是老司機了，還有個方法不用測蛋白濃度，只要在顯微鏡下估測各組細胞密度差不多，直接提蛋白變性上樣跑 WB 即可。但老司機也有翻車的時候，請慎用。