超敏感OligoGreen ssDNA定量試劑盒推薦步驟

OligoGreen ssDNA定量試劑是一種超敏感的熒光核酸染料，用于定量溶液中的寡核苷酸和單鏈DNA（ssDNA）。短的合成寡核苷酸在許多分子生物學(xué)技術(shù)中被使用，如DNA測序、定點突變、DNA擴(kuò)增和原位雜交。然而，傳統(tǒng)的寡核苷酸定量方法不夠敏感，通常需要高濃度的樣品。目前特別常用的寡核苷酸和ssDNA濃度測量方法是通過測量在260 nm處的吸光度（A260）。吸光度法的主要缺點是核苷酸對信號的顯著貢獻(xiàn)、核酸制備中常見污染物的干擾以及測量的相對不敏感性（0.1 A260大約相當(dāng)于3μg/mL的合成24堿基M13測序引物）。相比之下，

Biogradetech OliGreen ssDNA定量試劑可以使研究人員使用標(biāo)準(zhǔn)熒光分光光度計和熒光激發(fā)和發(fā)射波長將寡核苷酸或ssDNA定量至低至100 pg/mL（在2 mL檢測體積中為200 pg）。這種敏感性比吸光度法高出10,000倍。使用熒光微孔板閱讀器，我們可以檢測到低至1 ng/mL（在200 μL檢測體積中為200 pg）的寡核苷酸或ssDNA。

Biogradetech還使用OliGreen試劑定量了幾個ssDNA樣品，包括M13和fX174病毒DNA以及變性的牛胸腺DNA，并獲得了類似的敏感性。OliGreen試劑可以檢測到從100 pg/mL到1 μg/mL的寡核苷酸濃度范圍。此外，Biogradetech已經(jīng)證明，OliGreen試劑的線性在存在各種潛在化合物的情況下仍然穩(wěn)健，包括鹽、尿素、乙醇、氯仿、洗滌劑、蛋白質(zhì)、ATP和瓊脂糖；長度為六個堿基或更少的短寡核苷酸不會干擾定量測量。

艾美捷OligoGreen ssDNA定量試劑盒*2000次* 基本參數(shù)：

目錄號：B-CHK002

規(guī)格：1mL

儲存：在-20°C下儲存

OligoGreen ssDNA定量試劑盒推薦的步驟：

該實驗步驟適用于具有2 mL檢測體積的標(biāo)準(zhǔn)熒光比色皿。如果在微孔板中進(jìn)行分析，請相應(yīng)調(diào)整所示的體積。例如，建議使用200 μL體積的96孔微孔板。

1. TE緩沖液的制備

準(zhǔn)備TE稀釋緩沖液，由10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5組成，用于稀釋OliGreen試劑和寡核苷酸/ssDNA樣品。由于OliGreen試劑是一種高靈敏度的ssDNA檢測試劑，使用不含有核酸污染的TE溶液非常重要。OliGreen ssDNA定量試劑盒中包含的20倍濃縮TE緩沖液不含核酸酶和核酸。通過將濃縮緩沖液以20倍稀釋在不含DNA酶的無菌蒸餾水中，制備1X TE工作液。

2. OliGreen工作液的制備

在實驗開始前，通過將濃縮的DMSO溶液以200倍稀釋在10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5（TE緩沖液）中，制備OliGreen試劑的水溶性工作液。例如，為了準(zhǔn)備足夠分析20個樣品的工作液，將100 μL的OliGreen定量試劑加入19.9 mL的TE緩沖液中。建議使用塑料容器而不是玻璃容器來制備該溶液，因為試劑可能吸附在玻璃表面上。由于OliGreen試劑對光敏感，應(yīng)通過用鋁箔覆蓋或存放在黑暗的地方來保護(hù)工作液。為了獲得最佳結(jié)果，應(yīng)在制備后幾個小時內(nèi)使用該溶液。

3.寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備

3.1在TE beffer中制備濃度為2μg/mL的寡核苷酸儲備溶液。基于260nm處的吸光度，在具有1cm路徑長度的比色皿中測量寡核苷酸的濃度（A260）。1.0的AnA260對應(yīng)于寡核苷酸溶液的濃度為30-35μg/mL。

3.2對于高范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示，將2μg/mL寡核苷酸儲備溶液稀釋到一次性試管（或用于轉(zhuǎn)移到石英試管的塑料管）中。然后將1.0 mL OliGreenreagent水溶液加入每個試管中。充分混合，在室溫下孵育2-5分鐘，避光3.3培養(yǎng)后，使用熒光分光光度計或熒光微板讀取器在標(biāo)準(zhǔn)熒光波長（激發(fā)~480 nm，發(fā)射~520 nm）下測量樣品的熒光。

3.4從每個樣品的熒光值中減去空白的熒光值。使用校正的數(shù)據(jù)生成熒光與寡核苷酸濃度相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。3.5對于低范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線（從100 pg/mL到50 ng/mL），將100 ng/mL低聚核苷酸儲備溶液（在步驟1.1中制備）稀釋到一次性試管（或轉(zhuǎn)移到石英試管的塑料管）中

4.樣品分析

4.1在一次性試管中，將TE緩沖液中的實驗寡核苷酸溶液稀釋至1.0 mL的最終體積。您可能需要為多個實驗樣品準(zhǔn)備稀釋液。高度稀釋樣品有助于減少某些污染物的干擾。但是，避免使用極小的樣品體積，因為它們很難準(zhǔn)確地移液。

4.2向每個樣品中加入1.0 mL OliGreen工作溶液。在室溫下培養(yǎng)2-5分鐘，避免暴露在光下。

4.3使用與生成標(biāo)準(zhǔn)曲線相對應(yīng)的儀器參數(shù)測量樣品的熒光（參見步驟3.3和3.5）。為了最大限度地減少光漂白效應(yīng)，保持所有樣品的熒光測量時間一致。

4.4從每個樣品的熒光值中減去空白的熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定寡核苷酸的濃度。

4.5使用不同稀釋度的試劑重復(fù)測量樣品，以確認(rèn)定量結(jié)果。

文獻(xiàn)參考：

1. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7,133（1997）; J Chromatogr A 755,271（1996）

該試劑僅用于科學(xué)研究領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。