細(xì)胞毒性小或無的FuGENE SI RNA轉(zhuǎn)染試劑，使用指南

FuGENE SI RNA轉(zhuǎn)染試劑利用與 DNA 轉(zhuǎn)染試劑相同的溫和可靠性，FuGENE SI，這是一種為 siRNA 傳遞而設(shè)計的創(chuàng)新 RNA 轉(zhuǎn)染試劑。FuGENE SI 是一種 100% 合成的多組分轉(zhuǎn)染試劑，專為將 RNA 分子傳遞到真核細(xì)胞系而設(shè)計。

FuGENE SI轉(zhuǎn)染試劑是一種多組分試劑，它能與siRNA、miRNA和其他小RNA形成復(fù)合物，然后安全高效地將其運輸?shù)秸婧思?xì)胞內(nèi)。

艾美捷FuGENE SI RNA轉(zhuǎn)染試劑（#SI-1000）的優(yōu)勢包括：

在對細(xì)胞溫和的同時，提供優(yōu)質(zhì)的敲低效率。

在許多常見的細(xì)胞類型和難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中具有高轉(zhuǎn)染效率。

細(xì)胞毒性z小或無，允許您使用較少的細(xì)胞進(jìn)行工作，并消除了更換培養(yǎng)基的要求。

需要z小的優(yōu)化。

靈活且快速的協(xié)議。

RNA干擾：

FuGENE SI專為將siRNA、miRNA和其他小RNA輸送到常規(guī)和難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系而設(shè)計。以10nM的siRNA作為起點。

細(xì)胞培養(yǎng)條件：

通過使用經(jīng)常傳代、增殖良好（好處于對數(shù)生長期）、并以一致的密度接種的細(xì)胞，z小化轉(zhuǎn)染效率的變異性。

其他培養(yǎng)基添加劑：

在某些細(xì)胞類型中，通常包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中的抗菌劑（例如，抗生素和殺真菌劑）可能對FuGENE SI轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生不利影響。如果可能，z初實驗時排除這些添加劑。一旦建立了高效率的條件，可以在監(jiān)測您的轉(zhuǎn)染結(jié)果的同時重新添加這些組分。

孵育時間：

將細(xì)胞孵育24至72小時。孵育時間的長度取決于siRNA基因靶標(biāo)、被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，以及所使用的下游檢測方法。在此孵育期后，使用適合您系統(tǒng)的檢測方法測量基因或蛋白表達(dá)。

附加所需試劑和耗材：

1.) 無菌、無血清的DMEM培養(yǎng)基，無添加劑或補充劑。

2.) siRNA、miRNA或相關(guān)的小RNA。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備：

選擇以下選項之一：

選項 1：快速前向協(xié)議：

在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，接種細(xì)胞（通常是在傳統(tǒng)協(xié)議中細(xì)胞接種量的2倍，即在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞）。直接進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

選項 2：傳統(tǒng)前向協(xié)議：

在轉(zhuǎn)染實驗前一天，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，并進(jìn)行接種。將細(xì)胞放置在孵化器中過夜。

選項 3：反向（高通量篩選）協(xié)議：

按照說明在試劑板中制備FuGENE SI和siRNA復(fù)合物，直接將細(xì)胞添加到含有復(fù)合物的試劑板中（通常是在傳統(tǒng)前向協(xié)議中細(xì)胞接種量的2倍）。

如何使用FuGENE SI RNA轉(zhuǎn)染試劑？

概述的協(xié)議將生成足夠的主混合液，用于轉(zhuǎn)染單個35毫米培養(yǎng)皿、6孔板的一個孔、24孔板的五個孔，或96孔板的二十五個孔，比例為推薦起始比例（每個96孔板孔0.3微升FuGENE SI + 1皮摩爾siRNA）。對于進(jìn)一步的擴(kuò)展和其他容器尺寸，請參見表1。

1.) 使用前讓FuGENE SI轉(zhuǎn)染試劑、RNA和培養(yǎng)基調(diào)整至室溫。旋渦混合一秒，或倒置FuGENE SI轉(zhuǎn)染試劑瓶以混合。

2.) 在兩個不同的管中用無血清培養(yǎng)基（無抗生素或殺真菌劑）稀釋FuGENE SI試劑和siRNA：

標(biāo)記兩個管：1.) “FuGENE SI" 2.) “siRNA"。

管1：通過將7.5微升FuGENE SI吸入117.5微升培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備125微升稀釋的FuGENE SI。立即輕敲管子或旋渦混合一秒以混合。

管2：通過將2.5微升10微摩爾siRNA吸入122.5微升培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備125微升200納摩爾siRNA。輕敲管子或旋渦混合以混合。

3.) 形成FuGENE SI和siRNA復(fù)合物：

將125微升稀釋的siRNA（管2 “siRNA"）加入到125微升稀釋的FuGENE SI（管1 “FuGENE SI"）中，制成250微升的復(fù)合溶液。輕敲管子或旋渦混合一秒以混合。

4.) 孵育siRNA-FuGENE SI復(fù)合物：

在室溫下孵育siRNA-FuGENE SI復(fù)合物5分鐘（z長可達(dá)15分鐘）。

5.) 將siRNA-FuGENE SI復(fù)合物加入細(xì)胞：

從孵化器中取出培養(yǎng)容器。無需移除生長培養(yǎng)基。以滴加方式將siRNA-FuGENE SI復(fù)合物加入細(xì)胞。搖動孔板或燒瓶以確保分布到整個板表面。

35毫米容器：加入250微升至孔中（每個孔z終使用量：25皮摩爾siRNA + 7.5微升FuGENE SI）

24孔板：每個孔加入50微升（每個孔z終使用量：5皮摩爾siRNA + 1.5微升FuGENE SI）

96孔板：每個孔加入10微升（每個孔z終使用量：1皮摩爾siRNA + 0.3微升FuGENE SI）

關(guān)于向其他容器尺寸添加復(fù)合物的數(shù)量的詳細(xì)信息，請參見表1。

6.) 孵育細(xì)胞24-72小時。然后，通過選擇的方法分析轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

注意：

與任何實驗一樣，包括適當(dāng)?shù)膶φ铡?zhǔn)備未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孔、僅含轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞孔，以及適當(dāng)?shù)年栃院完幮詸z測對照孔。

siRNA與FuGENE SI的z佳比例，以及添加復(fù)合物的z佳總量可能因細(xì)胞系、細(xì)胞密度、檢測日和基因靶標(biāo)而異。我們建議在96孔板的每個孔中測試0.1-10.0皮摩爾siRNA和0.15-0.6微升FuGENE SI。

表1：制備各種培養(yǎng)容器尺寸的FuGENESI+siRNA復(fù)合物的指南表1強調(diào)了各種容器尺寸的起始量，使用1pmol siRNA+0.3ul FuGENE SI建議的96孔培養(yǎng)容器單孔起始量。請注意，這只是一個起點，對于特定的細(xì)胞系和應(yīng)用，可能需要優(yōu)化siRNA+FuGENESI比例和每孔添加的復(fù)合物總量。