CUT&Tag試劑盒：從細(xì)胞到文庫(kù)DNA的過(guò)程不到5小時(shí)

CUT&Tag試劑盒背景資料：

在體內(nèi)富集組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子（TF）復(fù)合的DNA，然后進(jìn)行下一代測(cè)序，為研究全基因組蛋白質(zhì)-DNA相互作用提供了有利的工具。它允許分析與活細(xì)胞中的DNA序列結(jié)合的特定蛋白質(zhì)。這種分析要求該方法可靠地鑒定真正的靶蛋白富集區(qū)域，特別是從有限的細(xì)胞樣品中。這些樣品可以包括從組織中分離的稀有細(xì)胞群、從整個(gè)細(xì)胞群中分選的特定細(xì)胞和原代培養(yǎng)的亞群細(xì)胞如胚胎細(xì)胞。此外，該方法應(yīng)確保富集的DNA包含Z小的背景，并且蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合區(qū)域的作圖具有Z小的偏差和高分辨率。長(zhǎng)期以來(lái)用于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要方法是染色質(zhì)免疫沉淀，然后測(cè)序（ChIP-Seq）。然而，ChIP的主要限制是它需要1）大量的輸入材料，細(xì)胞或組織，以產(chǎn)生超過(guò)背景噪聲的足夠強(qiáng)的信號(hào);和2）在初始固定步驟期間交聯(lián)。有幾種先進(jìn)的方法可用于減少細(xì)胞數(shù)量或提高分辨率的ChIP-Seq。這些方法包括ChIP-exo、ChIPmentation。ChIP-exo提供了高分辨率的映射，但很耗時(shí)，并且需要大量的輸入細(xì)胞。雖然ChIPmentation使用轉(zhuǎn)座酶和測(cè)序兼容銜接子來(lái)實(shí)現(xiàn)ChIP過(guò)程中的連接整合，但它遵循傳統(tǒng)的緩慢（2天）ChIP程序，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高分辨率映射。

CUT&Tag試劑盒描述：

EpiNext™ cTIP（CUT& Tag In-Place）測(cè)序試劑盒是 從哺乳動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)始成功進(jìn)行cTIP-Seq所需的一整套試劑。該試劑盒旨在從低輸入細(xì)胞/染色質(zhì)中富集蛋白質(zhì)（組蛋白或強(qiáng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子）特異性DNA復(fù)合物，并使用Illumina平臺(tái)（如Illumina Genome Analyzer II、HiSeq和MiSeq系統(tǒng)）制備用于下一代測(cè)序的文庫(kù)。創(chuàng)新的工作原理、優(yōu)化的方案和試劑盒的組分允許以Z小化的非特異性背景水平捕獲靶蛋白/DNA復(fù)合物，并快速構(gòu)建非條形碼（單重）和條形碼（多重）文庫(kù)，以便以較小的偏差和高分辨率映射靶蛋白-DNA相互作用區(qū)域。

艾美捷CUT&Tag試劑盒特點(diǎn)：

1、高濃縮： 使用d特的核酸切割酶混合物，其具有低序列偏倚，以同時(shí)片段化染色質(zhì)并切割/去除靶蛋白/DNA復(fù)合物兩端的任何DNA序列，而不影響靶蛋白占據(jù)的DNA。因此，可以可靠地鑒定真正的靶蛋白富集區(qū)域，并且可以實(shí)現(xiàn)高分辨率定位。

2、低投入材料： 穩(wěn)健的無(wú)超聲片段化、未結(jié)合DNA切割和免疫捕獲均在同一單管中進(jìn)行，并采用珠上連接。該方法允許在細(xì)胞和組織中使用，并允許以Z小的樣品損失對(duì)靶蛋白進(jìn)行Z大的降解保護(hù)。結(jié)果，輸入細(xì)胞量可以少至500個(gè)細(xì)胞或染色質(zhì)量可以低至50 ng。

3、原位標(biāo)記： 在DNA純化之前，DNA銜接子與染色質(zhì)的珠上連接（原位）導(dǎo)致DNA片段大小增加，允許純化與轉(zhuǎn)錄因子（TF）結(jié)合的非常短的片段（例如：< 70 bp）用于文庫(kù)構(gòu)建。

4、Z低背景： 在靶蛋白/DNA復(fù)合物的兩（2）端原位切割未結(jié)合的DNA序列能夠使免疫捕獲/測(cè)序背景Z小化，從而允許使用<1000萬(wàn)個(gè)讀數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

5、快速、簡(jiǎn)化的程序： 從細(xì)胞到文庫(kù)DNA的過(guò)程不到5小時(shí)。

6、非常方便：該試劑盒包含CUT&Tag原位測(cè)序每個(gè)步驟所需的所有組件，足以用于蛋白質(zhì)/DNA捕獲和捕獲的DNA文庫(kù)制備，從而使cTIP（CUT&Tag In-Place）測(cè)序試劑盒Z方便，結(jié)果可靠且一致。

CUT&Tag試劑盒檢測(cè)原理：

EpiNext™ cTIP（CUT&Tag In-Place）測(cè)序試劑盒包含了從哺乳動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行成功的cTIP-Seq所需的所有必要試劑。在反應(yīng)中，從細(xì)胞中分離出細(xì)胞核。目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物與感興趣的ChIP級(jí)抗體結(jié)合/捕獲。使用d特的核酸切割酶混合液，染色質(zhì)被碎片化，目標(biāo)蛋白/DNA復(fù)合物兩端的DNA序列被切割/移除。在此過(guò)程中，被目標(biāo)蛋白占據(jù)的DNA序列不受影響。接頭被連接到珠子上與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。然后，連接的DNA被釋放、純化，并使用高保真PCR混合液進(jìn)行擴(kuò)增，以構(gòu)建文庫(kù)DNA。DNA隨后被清潔、釋放和洗脫。試劑盒中包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照抗體（抗H3K9me3）、一個(gè)陰性對(duì)照非免疫IgG和對(duì)照染色質(zhì)，這些可以用來(lái)在PCR/生物分析儀步驟中展示試劑盒的效果和性能。

使用EpiNext™cTIP（CUT和Tag In Place）測(cè)序試劑盒對(duì)文庫(kù)片段的大小分布：用對(duì)照抗體（H3K9me3）從Hela細(xì)胞分離的500 ng染色質(zhì)中捕獲組蛋白/DNA復(fù)合物，并用于DNA文庫(kù)制備。295 bps的峰值反映了單核小體的插入大小（約150 bps）