CUT&RUN丨染色質(zhì)分析高效工具：CUT&RUN RNA m6A-Seq

CUT&RUN：

染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 和 ChIP-seq 等能夠比對蛋白-DNA 相互作用的方法的開發(fā)，使得人們越來越了解到異常的表觀遺傳調(diào)節(jié)可以引起許多人類疾病。核酸酶靶向切割和釋放 (CUT&RUN) 是一項(xiàng)可用于染色質(zhì)分析的新技術(shù)。

CUT&RUN 是一種使用靶標(biāo)特異性一抗和Protein A - Protein G - 微球菌核酸酶 (pAG-MNase) 分離特異性蛋白-DNA 復(fù)合體的體內(nèi)方法[1, 2, 3]。從細(xì)胞到 DNA 只需 1 至 2 天，并且它可以自動化，實(shí)現(xiàn)大通量和可重復(fù)性[4]。

為了分離目標(biāo)蛋白-DNA 復(fù)合體，首先收集細(xì)胞，然后讓其結(jié)合 Concanavalin A 包被的磁珠，以方便細(xì)胞處理，并在后續(xù)清洗過程中大程度減少細(xì)胞丟失。細(xì)胞膜用洋地黃皂苷透化，便于一抗進(jìn)入胞核，在胞核，一抗會結(jié)合組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子或目標(biāo)輔因子。pAG-MNase 融合蛋白的 pAG 結(jié)構(gòu)域隨后結(jié)合一抗重鏈，從而使酶靶向至目標(biāo)染色質(zhì)區(qū)域。添加 Ca2+ 可激活 pAG-MNase，以啟動 DNA 消化。這會使被切割的染色質(zhì)復(fù)合體從基因組染色質(zhì)中擴(kuò)散出來、脫離胞核并進(jìn)入樣品上清液，使用 DNA 離心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀的方法便可從上清液中收集這些被切割的染色質(zhì)復(fù)合體。

純化、富集的 DNA 隨后使用 qPCR 檢測和定量，或用下一代測序分析 (NGS) 與全基因組比對構(gòu)建DNA 測序文庫。

艾美捷CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒（P-9016）檢測原理：

EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒包含了從總RNA開始進(jìn)行成功的m6A-Seq所需的所有必要試劑。在反應(yīng)中，目標(biāo)m6A含有區(qū)域兩端的RNA序列被切割/移除，并且使用結(jié)合有m6A捕獲抗體的珠子捕獲目標(biāo)m6A含有片段。然后，目標(biāo)m6A含有的RNA片段被回收、釋放、逆轉(zhuǎn)錄，并連接接頭。連接后的第一條鏈cDNA被擴(kuò)增，然后用作文庫合成的模板。使用高保真PCR混合液進(jìn)行文庫cDNA的擴(kuò)增和索引。然后使用結(jié)合珠子清理cDNA。試劑盒中還包括一個(gè)陰性對照非免疫IgG，可以用來展示試劑盒的效果，并在富集RNA定量或生物分析儀分析步驟中展示性能。

庫片段的大小分布。用抗m6A抗體（EpigenTek，#A-1801）從3 ug總RNA中富集m6A片段，并用于DNA文庫制備。195 bps的峰值反映了m6A抗體結(jié)合的RNA的插入大?。s55 bps）。

CUT&RUN相關(guān)文獻(xiàn)：

1. Skene PJ, et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. (2018) Nat. Protoc 13(5), 1006-1019. Pubmed29651053

2. Meers MP, et al. Improved CUT&RUN chromatin profiling and analysis tools.(2019) BioRxiv 1, 569129. bioRxiv 569129

3. Skene PJ and Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. (2017) Elife 6, e21865. Pubmed28079019

4. Janssens DH, et al. (2018) Epigenetics Chromatin 22(1), 74. Pubmed30577869