一管式點(diǎn)突變試劑盒

一管式點(diǎn)突變試劑盒基因的定點(diǎn)突變是重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于載體構(gòu)建、基因改造、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈 DNA 模板，而得到單鏈 DNA 模板又需要
先將基因克隆到類似 M13 這種載體中，操作過程冗長。為了克服這些缺點(diǎn)，本公司將突
變位點(diǎn)設(shè)計(jì)到一對(duì)互補(bǔ)的引物中，用高保真擴(kuò)增質(zhì)粒模板，然后用 Dpn I 去除原始的甲
基化模板，新合成的 DNA 通過互補(bǔ)形成帶切口的雙鏈質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。
本方法過程示意圖如下：

一管式點(diǎn)突變試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 直接使用質(zhì)粒 DNA 作為模板，免去了制備單鏈 DNA 的步驟。
2. 基于高保真 PCR，對(duì)模板 DNA 序列沒特殊要求，可以用于突變?nèi)魏涡蛄小?br />同時(shí)對(duì)模板的需求量很少。
3. 一管式，全部在一個(gè)優(yōu)化的緩沖體系中完成，非常簡單。
4. 使用 Dpn I 去除未突變模板，突變效率高達(dá) 90%。
5. 可用于制備點(diǎn)突變，缺失突變和插入突變。
6. 本產(chǎn)品 A 型適用于 8 kb 以下，B 型適用于 8-15 kb。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) A 型 10 次包裝 B 型 10 次包裝
高保真酶 A 型 10 uL 無
高保真酶 B 型 無 10 uL
5×高保真酶 Buffer A 型 100 uL 無
5×高保真酶 Buffer B 型 無 100 uL
dNTP（2.5 mM each） 50 uL 50 uL
Dpn I 酶 10 uL 10 uL
超純水 100935 1 mL 1 mL
使用手冊 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑 質(zhì)粒 DNA、突變引物、細(xì)菌轉(zhuǎn)化試劑
使用方法 一、 引物設(shè)計(jì)及注意事項(xiàng)
用于特定基因突變的引物必須用戶單獨(dú)設(shè)計(jì)，請參考如下一些基本原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。
1. 共需設(shè)計(jì)兩條*互補(bǔ)的一對(duì)引物，它們覆蓋要擴(kuò)增的突變區(qū)位點(diǎn)，突變位點(diǎn)
zui放在引物的中心?？梢韵燃性O(shè)計(jì)一條，然后就可得互補(bǔ)的另一條引物。
2. 引物的長度通常為 25-45 個(gè)堿基。引物中突變位點(diǎn)任何一側(cè)都必需滿足 Tm 大
于 45 的條件，Tm 計(jì)算方式為 Tm=4×(GC 堿基數(shù))＋2×(AT 堿基數(shù))。例如
引物 agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，它的突變位點(diǎn)
AAG 所放位置使左側(cè) Tm＝46；右側(cè) Tm＝48，均大于 45。
3. 盡量把引物的 GC 含量控制在 40％-60％，結(jié)尾的 1-3 個(gè)堿基zui是 G 或 C。
4. 盡量使引物不要產(chǎn)生非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體。
5. zui使用經(jīng)過 PAGE 純化的引物或更高純度的引物。
二、待突變模板質(zhì)粒的選擇
1. 必需使用從 dam＋的大腸桿菌(這類菌中質(zhì)?？梢员患谆?中抽提得到的質(zhì)粒
用于基因定點(diǎn)突變，否則 Dpn I 不能把沒有酶切的質(zhì)粒 DNA 切除，產(chǎn)生大量
的假陽性。常用的大部分大腸桿菌都是 dam＋的，包括 DH5α、JM109 等。
不能使用 JM110 和 SCS110 以及其它 dcm-菌種。
2. 待突變質(zhì)粒和目的基因的 GC 含量應(yīng)該在 40-55％，沒有任何 GC 含量超過
70%、長度在 50bp 以上的區(qū)域。如果質(zhì)粒 GC 含量過高，請先把目的基因克
隆到其它合適的載體上，再進(jìn)行基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。如果目的基因 GC 含量過
高，而突變位點(diǎn)不在高 GC 含量區(qū)域，可以先把該基因的不含高 GC 含量的一
個(gè)區(qū)域克隆出來，進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如
果突變位點(diǎn)在高 GC 區(qū)，則可以使用高 GC PCR 反應(yīng)試劑。
三、 基因定點(diǎn)突變反應(yīng)
1. 在一個(gè)塑料離心管中加入下列成分：
待突變模板質(zhì)粒 0.1-0.5 ug
5×高保真酶 Buffer 10 uL
引物一 (10-20 uM) 1 uL
引物二 (10-20 uM) 1 uL
dNTP Mix (2.5 mM each) 4 uL
補(bǔ)水到 49 uL
2. 加入 1 uL 高保真 DNA 聚合酶，混勻，如果 PCR 儀沒有熱蓋則需要加少量石
蠟油。放入 PCR 儀器中按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)
變性 95℃ 1 分鐘 1 次
PCR
（注：只 18 次循環(huán)）
95℃ 40 秒
60℃ 1 分鐘 18 次
68℃ 1 分鐘/Kb
延伸 72℃ 10 分鐘 1 次
保存 4℃ 長時(shí)間保持
四、Dpn I 消化：
PCR 反應(yīng)后，直接在 PCR 反應(yīng)體系中加入 1uL Dpn I 內(nèi)切酶 （該酶在甘油保
存液中會(huì)下沉到管底，故用前需要充分混勻）。DpnI 可以酶切雙鏈都被甲基化的模
板質(zhì)粒，也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質(zhì)粒?；靹蚝?37℃孵育 2 小時(shí)后樣品可以
直接用于轉(zhuǎn)化，或者-20℃保存?zhèn)溆谩?br />五. 轉(zhuǎn)化、挑克隆鑒定：
每 100 微升感受態(tài)細(xì)菌（轉(zhuǎn)化效率必須在 107 /ug 以上）中可以加入 5-10
微升經(jīng)過Dpn I消化后的突變產(chǎn)物，按照所使用的感受態(tài)細(xì)菌的操作方法進(jìn)行操作。
如果 PCR 使用了石蠟油，在轉(zhuǎn)化時(shí)千萬別把它帶入轉(zhuǎn)化反應(yīng)，否則會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)
化效率。在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌全部涂布到含有適
當(dāng)抗生素的平板上培養(yǎng)過夜。通常會(huì)得到 50 個(gè)以下的克隆，可按常規(guī)方法制備質(zhì)
粒并測序。
六、常見問題：
1. 轉(zhuǎn)化后沒有克隆或克隆數(shù)極少：(1) 感受態(tài)細(xì)菌效率不夠高，請檢測一下感受態(tài)
細(xì)胞的效率，確保轉(zhuǎn)化效率在 107 /ug。(2) 把 Dpn I 消化后的產(chǎn)物用常規(guī)的乙醇
沉淀濃縮，這樣就可以把所有的產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化。(3) 優(yōu)化基因定點(diǎn)突變中的PCR
參數(shù)?？梢园褄ui初的 95℃變性時(shí)間延長為 2 分鐘，循環(huán)中 95℃變性的時(shí)間延長至
1 分鐘，把循環(huán)中的 68℃的延伸時(shí)間改為 1.5 分鐘/kb 至 2 分鐘/kb，退火可以
改為 60-55℃或 65-55℃等的 touch down，退火時(shí)間也可以適當(dāng)延長。(4) 引物
設(shè)計(jì)有問題。通過突變反應(yīng)中的 PCR 沒有很好地?cái)U(kuò)增出預(yù)期的突變質(zhì)粒。
2. 有克隆，但沒有或很難檢測到預(yù)期的突變克?。?1) 使用的待突變的模板質(zhì)粒量
過多，導(dǎo)致 Dpn I 消化時(shí)不*，可減少質(zhì)粒用量。
3. 有突變克隆，但突變位點(diǎn)不是預(yù)期的位點(diǎn)：(1) 引物設(shè)計(jì)不佳，退火溫度過低，
導(dǎo)致引物退火到錯(cuò)誤的地方。(2) 引物質(zhì)量較差，沒有經(jīng)過 PAGE 純化。這樣引物
中通常會(huì)含有比設(shè)計(jì)的引物要短的特異性較差的引物，容易導(dǎo)致非預(yù)期的突變。