T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒是基于沙門氏噬菌體 T3 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它
利用含有 T3 啟動子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T3 啟動子下游開始合成
與模板 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。

T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)
驗，不需耍單獨(dú)準(zhǔn)備每一個成份。
2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。
3. 模板 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
4. 可以合成的 RNA 的*長度在 20 nt 到 5000 nt 之問。
5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每 ug DNA 模板可以合成 2-6 ug RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-
蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗。
規(guī)格及成分 成份 編號 塑料袋包裝
轉(zhuǎn)錄預(yù)配液（2×） 91108A 0.5 mL
陽性對照 DNA
（1.3 kb 片段） 91108B
20 μL
（10 ng/μL）
T3 RNA 聚合酶混合液 120309 50 μL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手冊 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑 如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板，則需要 RNase-free DNase 、Tris 飽
和酚、氯、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇（均可從本公司另購）
使用方法 一、制備 DNA 模板
PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾
點(diǎn)。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)?br />限制性內(nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動
子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物，則可以在設(shè)計引物時將 T3 啟動子序列
（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆
到載體上，則需要選擇有 T3 啟動子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T3 啟
動子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端zui不要是 3’突出。如果
是 3’突出（如選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則zui用 T4 DNA 聚合酶修
平。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中
一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污
染，所以在用作模板前，zui采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入
少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此判斷純化的
DNA 模板是否有殘留 RNase A。
二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1. 在一個 RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）按次序
加入下列成分：
成分 加入量 備注
DNA 模板 X uL
總量在 50 ng-1 ug（如果模板
是 PCR 片段，建議用 50 ng 左
右；如果模板是質(zhì)粒 DNA，建
議用 1 ug 左右；如果用本產(chǎn)品
提供的陽性對照，建議用 4 uL）
轉(zhuǎn)錄預(yù)配液（2×） 10 uL 需室溫時使用
T3 RNA 聚合酶
混合液
1 uL
本成分還含其他促進(jìn)劑，所以是
混合物
RNase-free 水 補(bǔ)水到 20uL
注：此為 20uL 反應(yīng)體系的用量，對其他體積的反應(yīng)體系，各成分的用
量可以按比例增減。如果需要標(biāo)記 RNA 探針，則需要定做 NTP 分開而
不是 NTP 預(yù)先混合的試劑盒。如果需要得到加帽 RNA，則需要加入自備
的加帽修飾核苷酸（本公司有各種加帽修飾核苷酸）。
2. 37℃保溫 1-2 小時。注意：延長保溫時間并不能提高產(chǎn)量。
3. 70℃加熱 10 分鐘滅活 T3 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3 uL 電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。
注：若需進(jìn)一步去除 DNA 模板，可參考下列操作步驟，但所用試劑需另行購買，
本試劑盒不提供。
1. 在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase
（CAT#:90903；3-5 U/uL）。
2. 37℃保溫 15-30 分鐘。
3. 補(bǔ)水到 100 uL，
4. 用自備的等體積（100 uL）的 Tris 飽和酚-氯抽提一次去除殘留的 DNase
和 RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃
混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。
8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free
水中后立即使用或放-80℃長期保存。
答客問
1、沒有 RNA 產(chǎn)物。zui常見原因是 DNA 模板有 RNase 污染，測試方法是用純
化的 RNA 跟模板 DNA 一起保溫，再檢測 RNA 是否降解。本試劑盒緩沖液
和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染嚴(yán)重，可能需要
用戶補(bǔ)加 RNase inhibitor。
2、RNA 產(chǎn)量低。zui常見的原因是 DNA 模板序列。在轉(zhuǎn)錄序列的*個和第二
個堿基zui都是 G，在前 14 個堿基內(nèi)避免有 U 存在。
3、RNA 長度比預(yù)期的短?？赡苁悄０逍蛄兄杏?T3 RNA 聚合酶的終止序列。
可以改用 SP6 或 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（啟動子也必須改成 SP6 或 T7 啟動
子）。
4、RNA 長度比預(yù)計的長。T3 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一樣，有不依賴
于模板的加尾功能，zui多有一半的 RNA 可以帶一個或兩個堿基的尾巴。如
果 RNA 長度比預(yù)計的長很多，使用的模板又是質(zhì)粒 DNA，則可能是質(zhì)粒
DNA 線性化不*。
5、5’單磷酸還是三磷酸。如果使用 GTP，則得到的 RNA 是三磷酸，體外轉(zhuǎn)
錄時如果保溫時間太長（如 12 小時），則有 50%的三磷酸會變成單磷酸。
如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入 GMP，則 T3 RNA 聚合酶將優(yōu)先使用 GMP，所得
RNA 產(chǎn)物中 5’端是單磷酸的比例將大大增加。
6、如何得到帶帽 RNA？需加入帶帽 NTP 類似物即可，本公司提供 5 種供選擇
（產(chǎn)品編號 130694-130698）。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（CAT#:91106）、SP6 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（CAT#:91107）

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