通用型RT-LAMP恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒

通用型RT-LAMP恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒可以用于 RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增，RT-LAMP 即逆轉(zhuǎn)錄和Loop-Mediated Isothermal Amplification（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）的結(jié)合，專門用于快速擴(kuò)增 RNA

通用型RT-LAMP恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒可以用于 RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增，RT-LAMP 即逆轉(zhuǎn)錄和Loop-Mediated Isothermal Amplification（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）的結(jié)合，專門用于快速擴(kuò)增 RNA。LAMP 是 2000 年才出現(xiàn)的一種新穎的等溫核酸擴(kuò)增方法。它利用 4 或 6 條模板專一的特異引物和具有鏈置換能力的 DNA 聚合酶，在等溫條件下(63℃左右) 30－60 分鐘完成擴(kuò)增。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于 RT-PCR 技術(shù)，同時(shí)還不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，不依賴任何專門的儀器設(shè)備。目前已成功應(yīng)用于人類及動(dòng)植物、細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌等病原體的快速檢測(cè)。

通用型RT-LAMP恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 高特異性，由于同時(shí)使用 4-6 條特異引物，所以特異性比 RT-PCR 更高。
2. 高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率可達(dá)到 10E9-10E10，比 PCR 靈敏一個(gè)數(shù)量級(jí)，
可檢測(cè)到單拷貝的 RNA 分子
3. 65℃左右完成 RT 和 LAMP 擴(kuò)增，不需要貴重的熱循環(huán)儀。
4. 即開(kāi)即用，包含了除引物和模板 RNA 外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，不需要昂貴的電泳、熒光 PCR 等儀器。
6. 提供擴(kuò)增對(duì)照，便于在遇到困難時(shí)分析原因。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 小扁盒包裝
RT-LAMP Mix（2×） 101114a 0.5 mL
AMV-Bst 混合液 101114b 75 uL
對(duì)照引物混合物 101114c 10 uL
對(duì)照模板 101114d 10 uL
MgCl2溶液，25 mM 90302 0.2 mL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手冊(cè) 101114sc 1 份
注：RT-LAMP Mix（2×）稀釋到 1×時(shí)，已經(jīng)有 8mM Mg2+，本試劑盒提
供的 MgCl2（25 mM）用于用戶優(yōu)化條件用。
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑 RNA 模板及 RT-LAMP 引物（4 或 6 條）
使用方法 1. 在冰上溶解除酶外的各種組份，混勻，稍離心。在反應(yīng)管中加入以下組
份：
成份 樣品管 陰性對(duì)照
RT-LAMP Mix（2×） 10 uL 10 uL
自備 FIP 引物終濃度 0.8 uM 0.8 uM
自備 BIP 引物終濃度 0.8 uM 0.8 uM
自備 F3 引物終濃度 0.2 uM 0.2 uM
自備 B3 引物終濃度 0.2 uM 0.2 uM
自備 Loop F 引物終濃度（可選項(xiàng)） 0.4 uM 0.4 uM
自備 Loop B 引物終濃度（可選項(xiàng)） 0.4 uM 0.4 uM
自備模板 RNA 1-100ng 不加
AMV-Bst 混合液 1.5 uL 1.5 uL
補(bǔ)水到 20 uL 20 uL
注：如在反應(yīng)管中加入本公司PCR級(jí)綠如藍(lán)染料1uL（水則少加1 uL），則
可直接在熒光定量PCR儀中進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。
2. 混勻，置于60-65℃保溫30-120分鐘。注意：如果不使用Loop引物，則
保溫120分鐘；如果使用Loop引物，則保溫30分鐘。
3. 80℃10分鐘滅活Bst DNA聚合酶。此酶有外切酶活性，所以必須滅活。
4. 產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆没蛄⒓从糜谙掠螜z測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物可選下列方法之一檢
測(cè):
1) 瓊脂糖凝膠電泳。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 uL，1-2%的瓊脂糖凝膠電泳，可
見(jiàn)LAMP特征性電泳圖譜；
2) 向擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入本公司PCR級(jí)綠如藍(lán)染料（另售）1 uL，混
勻，稍離心。將反應(yīng)管置于紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)中，紫外燈
下可見(jiàn)綠色熒光產(chǎn)生；
3) 熒光定量檢測(cè)。
5. 結(jié)果分析：
1) 如果沒(méi)有擴(kuò)增，則需要用本試劑提供的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。本試劑
盒提供陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)按下表設(shè)置：
成份 陽(yáng)性對(duì)照管
RT-LAMP Mix（2×） 10 uL
對(duì)照引物混合物 2 uL
對(duì)照模板 2 uL
AMV-Bst 混合液 1.5 uL
水 4.5 uL
混勻后，置于60℃保溫120分鐘，其余操作同上。注意：本對(duì)照引物
中沒(méi)有Loop引物，所以zui保溫120分鐘。
如果陽(yáng)性對(duì)照能夠擴(kuò)增出，則說(shuō)明試劑盒沒(méi)有問(wèn)題，可能是模板或引
物的問(wèn)題。如果陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，則是試劑盒的問(wèn)題，請(qǐng)跟
廠家。
注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)：
1. 引物設(shè)計(jì)對(duì)成功擴(kuò)增十分關(guān)鍵。除用于 SNP 分型外，盡量以保守區(qū)
設(shè)計(jì)引物。
2. 引物至少包括 F3/B3 和 FIP/BIP，加入環(huán)狀引物 F loop/B loop
可以使反應(yīng)速度大大提高。
3. 應(yīng)優(yōu)化引物序列、GC 含量和盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)。
4. 反應(yīng)中各個(gè)引物的濃度及比例對(duì)擴(kuò)增效果有一定的影響。
5. 建議先將所有引物混合在一起，配制成 10?濃度以方便使用。
6. LAMP 擴(kuò)增具有特異性好、靈敏度高、時(shí)間快、不需要特殊儀器設(shè)
備等優(yōu)點(diǎn)。但太高的靈敏度使得其比普通 PCR 擴(kuò)增更加容易污染導(dǎo)
致假陽(yáng)性。因此，必須高度重視擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。常規(guī)措施包括嚴(yán)
格的實(shí)驗(yàn)分區(qū)、添加 UNG 和 dUTP（可能導(dǎo)致反應(yīng)效率下降）、使
用熒光定量等不開(kāi)蓋檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室一旦遭到污染，所有相關(guān)試
劑必須全部更換，必要時(shí)還得更換實(shí)驗(yàn)室。
7. 要確證擴(kuò)增的為目標(biāo)基因，可以使用特定的限制性酶切和/或
Southern 雜交。
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請(qǐng)勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品等用途。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 Bst DNA 聚合酶，通用型 LAMP 擴(kuò)增試劑盒