隨機引物法DNA探針標記試劑盒（A）

隨機引物法DNA探針標記試劑盒（A）是基于 Feinberg 和 Vogelstein 發(fā)明的隨機引物標記法而開發(fā)出來的即用型DNA 探針標記試劑盒，標記過程由雙鏈 DNA 熱變性、隨機引物與單鏈 DNA 結(jié)合、在Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探針并摻入標記的核苷酸三步組成

隨機引物法DNA探針標記試劑盒（A）是基于 Feinberg 和 Vogelstein 發(fā)明的隨機引物標記法而開發(fā)出來的即用型DNA 探針標記試劑盒，標記過程由雙鏈 DNA 熱變性、隨機引物與單鏈 DNA 結(jié)合、在Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探針并摻入標記的核苷酸三步組成，
可用下面的示意圖表示：

隨機引物法DNA探針標記試劑盒（A）對 Feinberg 和 Vogelstein 經(jīng)典方法進行了改良，具有下列特點：
1. 提供的標記反應(yīng)液整合了除酶和模板外的所有成分，簡化了反應(yīng)加樣步驟，提高了
標記反應(yīng)的可重復(fù)性。
2. 使用無外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已標記 DNA 探針不會被酶降解。
3. 快速，zui快 1 小時即可完成標記反應(yīng)。
4. 得到的 DNA 探針比活性高（如果是同位素，可以達到 109cpm/ug DNA），檢測靈
敏度高。
5. 所需模版 DNA 量少（只需要 10ng 以上即可），DNA 可以是各種形狀（線狀和環(huán)狀）
的、也可以是單鏈或雙鏈的，長度在 100 bp 以上均可。
6. 得到的探針長度在 200-400 nt 之間，可以用于 Southern 雜交、Northern 雜交、
原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等。
7. 提供三種標記選擇，其中 90603A 可用于各種同位素標記和其他任何非同位素標記，
但需自備標記底物；90603B 和 90603C 可分別用于生物素和標記，不需自
備標記底物。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 小塑料盒包裝
2×A 型標記反應(yīng)液（自備標記物型） 90603A 50 uL（僅 A 型有）
2×B 型標記反應(yīng)液（生物素型） 90603B 50 uL（僅 B 型有）
2×C 型標記反應(yīng)液（DIG 型） 90603C 50 uL（僅 C 型有）
dATP，2 mM 90603D 10 uL（僅 A 型有）
dTTP，2 mM 90603D 10 uL（僅 A 型有）
dGTP，2 mM 90603D 10 uL（僅 A 型有）
dCTP，2 mM 90603D 10 uL（僅 A 型有）
Klenow exo-聚合酶（2U/uL） 90603E 5 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 90603sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑 0.5M EDTA（pH8.0）。如果是 A 型，則需要自備標記的核苷酸。
使用方法 1. 在一干凈的硅化的塑料離心管中加入下列成分：
成分 用量
模板 DNA 50-150 ng
2×標記反應(yīng)液(ABC 三種之一) 10 uL
超純水 補水到 15 uL
注意：非同位素標記物由于疏水性強，容易與常用的塑料離心管表面非特異性結(jié)合，
所以一定要使用硅化的塑料離心管。模板 DNA 并非越多越好，因為模板會在雜交反
應(yīng)中跟標記的探針雜交，競爭性抑制探針跟靶分子的雜交。
2. 沸水浴 5-10 分鐘，或在 PCR 儀上 100℃加熱 5-10 分鐘使 DNA 模版充分變性，
立即放冰上待用。注意：如果 PCR 儀器不能設(shè)置到 100℃，99℃加熱 5 分鐘也可。
3. 高速離心數(shù)秒使所有液體集中在管底，根據(jù)試劑盒類型加入下列成份：
試劑盒類型 成分及用量
A 型 dATP、dGTP、dCTP 各 1 uL（共 3uL，濃度均為 2mM）
自備的 2mM dTTP/標記 dUTP 混合物（見注）1uL
1 uL Klenow exo 聚合酶
B 型 1 uL Klenow exo 聚合酶
4 uL 超純水
C 型 1 uL Klenow exo 聚合酶
4 uL 超純水
注：上表中的 dTTP/標記 dUTP 混合物中 dTTP 和標記的 dUTP 的總濃度為 2mM
（在 20uL 體系中混合液的終濃度為 0.1mM，dTTP 與生物素或 DIG 標記的 dUTP
的比例為 65：35）。由于空間阻礙，并非標記生物素或 DIG 標記的 dUTP 越
多靈敏度越高，一般 dTTP 與標記 dUTP 的比例在 65：35 為*。但如果使用自
備 的 其 他 標 記 核 苷 酸， 如 fluorescein 、 hydroxycoumarin 、 resorufin 和
aminoallyl 標記的 dUTP，則用戶需要自己摸索其與 dTTP 之間的*比例，如果
使用 32P 標記的 dUTP，則比活為 3000Ci/mmol，濃度為好為 10uCi/uL，
并且不需要加入 dTTP。
4. 輕柔吹打混勻。如有液滴沾在管壁上，高速離心數(shù)秒使所有液體集中在管底。
5. 37℃保溫 1-20 小時。標記效率跟模版量和保溫時間相關(guān)，具體見下表：
模版 DNA 用量
（ng）
1 小時后探針合成量
（ng）
20 小時后探針合成量
（ng）
10 80 900
30 150 1350
100 350 1650
300 750 2200
1000 1300 2600
3000 1600 2600
6. 加 1 uL 自備的 0.5M EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)，立即放冰上待用或放-20℃保存
一年。用前需要加熱 100℃ 5 分鐘使 DNA 探針變性成單鏈，然后直接加入到雜交
反應(yīng)液中即可。如果電泳檢測，標記產(chǎn)物將是彌散狀態(tài)。
注意：本方法標記核苷酸摻入率*，因此可以不經(jīng)純化直接使用。如果需要純化，
注意不要用酚抽提法純化非同位素（生物素、DIG 和其他等）標記的 DNA 探針，
因為這些標記分子疏水性強，能使標記的 DNA 進入疏水的有機相而丟失，但可以
用乙醇沉淀和 Sephadex G50 回收（可另購非同位素探針柱式純化試劑盒）。對比
活高的同位素探針，由于其極其不穩(wěn)定，因此應(yīng)該立即使用，不要長久放置。
相關(guān)產(chǎn)品
PCR 法 DNA 探針標記試劑盒、加尾法 DNA 探針標記試劑盒、Biotin-11-dUTP，
DIG-11-dUTP、非同位素探針柱式純化試劑盒。