石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒

石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒是經(jīng)過精心優(yōu)化的、基于 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和 Taq DNA 聚合酶的雙酶一管式RT-PCR 試劑盒，它含有除模版 RNA 和其專一性引物以外的所有 RT-PCR 試劑，包括MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶、RT-PCR 緩沖液等，可以在同一反應(yīng)管內(nèi)完成 RNA→cDNA→PCR 反應(yīng) (RT-PCR 反應(yīng))，

石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒特點(diǎn)如下：
1. 一管式完成 RT-PCR 反應(yīng)，避免樣品交叉污染，尤其適合臨床應(yīng)用。
2. 即開即用，用戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備 RT-PCR 所需的各種試劑。
3. 主要成分只有兩個(gè) RT-PCR buffer 和 MMLV-Taq Mix，將加樣步驟減少到zui低，
極大降低了加樣誤差，增加了可重復(fù)性。
4. 使用范圍廣，適用于從病毒 RNA 到人 RNA 的各種 RNA 模板。
5. 高靈敏度，每個(gè) RT-PCR 體系zui低可以檢測 200 拷貝的 RNA 分子，可擴(kuò)增的模版
RNA 的zui長達(dá) 2000 nt。
6. 所得 RT-PCR 產(chǎn)物可以直接用于 AT 克隆。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 50 次包裝
雙酶一管式 RT-PCR Buffer（2×） 750 uL
MMLV-Taq Mix 100 uL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手冊 91202sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑
1. RNA 模板：總 RNA，mRNA。
2. 專一性引物和探針（引物、探針應(yīng)用 HPLC 或 PAGE 純化）。
3. RNase-free & DNase-free 的 tip 頭，離心管,薄壁 PCR 管等。
4. 各種規(guī)格的移液器。
5. 常規(guī)或 Real-time PCR 儀。本產(chǎn)品適用于下列 Realtime PCR 儀：ABI PRISM
7700、ABI PRISM 7500、ABI PRISM 7300、ABI PRISM 7000、MJ Opticon 、
BIORAD iCycler 、Roch LightCycler 等，具體使用方法請參照相應(yīng)儀器的說明
書。
使用方法 注意：所有離心管用前zui全部短暫離心幾秒使管壁上溶液沉淀到管底。下面以一個(gè)
30uL 體系的 RT-PCR 為例，如果體積不同，各成分用量需要適當(dāng)調(diào)節(jié)。
1. 在一干凈的無 RNase 的 PCR 管中，先加入下列成分：
成分 陰性對照 樣品
RNA 模板（自備，分下面三種情況） 無 見下
總 RNA 無 100-500 ng
或 poly(A) mRNA 無 10-500 ng
或體外轉(zhuǎn)錄得到的專一 RNA 無 0.01 pg-500ng
RNA 特異性引物一（自備） 終濃度 300nM 終濃度 300nM
RNA 特異性引物二（自備） 終濃度 300nM 終濃度 300nM
探針（僅對 Realtime RT-PCR） 終濃度 200nM 終濃度 200nM
RNase-free 水 補(bǔ)到 13 uL 補(bǔ)到 13 uL
雙酶一管式 RT-PCR Buffer（2×） 15 uL 15 uL
MMLV-Taq Mix 2 uL 2 uL
注：通常初次使用本試劑時(shí)，可用引物濃度 300nM，探針濃度 200nM 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體情況，在 200～800nM 范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度，在 50～400nM 范
圍內(nèi)調(diào)整探針濃度以達(dá)到*檢測效果。引物、探針、待檢樣品的具體加量用戶可以
根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，同時(shí)增減 DEPC 水用量，保證總反應(yīng)體積不變即可。
2. 輕柔混合均勻后放入 PCR 儀中進(jìn)行 RT-PCR。
3. 設(shè)定 RT-PCR 反應(yīng)條件時(shí)，一般將 RT 的條件設(shè)定成 42℃ 30 分鐘，后接 94℃變
性 5 分鐘，然后進(jìn)入 PCR 循環(huán)（PCR 參數(shù)將根據(jù)自備引物的 Tm 值由用戶自行決
定注）、zui后 72℃ 5 分鐘。對 Realtime PCR，在復(fù)性步驟設(shè)置熒光檢測，檢測通
道：FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
4. RT-PCR 結(jié)束后取 5-10 uL 電泳檢查。
注意事項(xiàng)
1. 使用已校準(zhǔn)的移液器，選用一次性 PCR 反應(yīng)管、離心管、tip 頭等進(jìn)行樣本處理及
配液等操作，所有用具應(yīng)不含 DNA 酶和 RNA 酶。
2. 引物、探針設(shè)計(jì)過程中應(yīng)盡可能避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體等現(xiàn)象的發(fā)生，探針的位置
盡可能靠近上游引物, PCR 目標(biāo)片段zui小于 200bp，盡可能在 150bp 以內(nèi)。
3. 實(shí)驗(yàn)樣品盡可能新鮮，提取過程應(yīng)嚴(yán)防 RNA 酶污染及操作不當(dāng)導(dǎo)致的 RNA 降解。
4. 使用本產(chǎn)品時(shí)建議對 RT-PCR 擴(kuò)增條件、引物濃度和樣品用量進(jìn)行調(diào)整，選擇zui適
當(dāng)?shù)囊餄舛?、樣品濃度?PCR 擴(kuò)增條件。
5. 本產(chǎn)品使用前應(yīng)在室溫充分融解，并用漩渦震蕩器充分混勻。
6. 統(tǒng)一配液后分裝以減少加樣誤差，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對照。
7. 禁止標(biāo)記 PCR 反應(yīng)管，避免外源性熒光信號(hào)干擾。
8. PCR 反應(yīng)管中不能有氣泡，否則會(huì)產(chǎn)生非特異的熒光信號(hào)。若有氣泡，可先用手指
將氣泡彈破，然后再低速離心消除。
9. 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀器連續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，zui間隔一小時(shí)以上再使用。
10. 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀需經(jīng)常校正和清潔載樣板板孔。
11. 若使用 Roch LightCyclerTM 熒光 PCR 儀，應(yīng)將毛細(xì)管放在專門套管中，以便分
裝反應(yīng)體系和加入待檢樣品。前述操作完畢應(yīng)低速離心數(shù)秒再將毛細(xì)管垂直緩慢放
入樣品架，以免折斷；若發(fā)生折斷，應(yīng)小心取出，用小毛刷擦拭干凈后方可進(jìn)
行擴(kuò)增。
12. 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)，避免 PCR 產(chǎn)物污染。
雙酶一管式RT-PCR試劑盒(MMLV-Taq)關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 兩管式 RT-PCR 試劑盒(CAT#:80206)：此產(chǎn)品適合于制備長 cDNA 用于構(gòu)建 cDNA 文
庫。