沙門氏菌和痢疾桿菌PCR聯(lián)合測定試劑盒

沙門氏菌和痢疾桿菌PCR聯(lián)合測定試劑盒沙門氏菌（Salmonella）引起的中毒病例在世界各地的食物中毒病例中所占數(shù)量比例非常高。在我國，70-80%細菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起的，沙門氏菌的檢測已成為食品質(zhì)量安全監(jiān)控的必檢衛(wèi)生指標。本試劑盒就是針對沙門氏菌腸毒素 stn 基因設(shè)計特異性引物，利用實時熒光定量 PCR 技術(shù)開發(fā)的沙門氏菌檢測試劑盒，它通過熒光染料實時顯示樣品模板 DNA 的量，并通過坐標曲線表示出來，結(jié)果直觀準確

沙門氏菌和痢疾桿菌PCR聯(lián)合測定試劑盒具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。
2. 熒光定量 PCR 檢測，反應(yīng)特異性強。
3. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分 成分 編號 50 次塑料袋包裝
2×qPCR Mix 90408 1.0 mL
stn 專一性引物對 yw13891390 200 μL
stn 陽性對照，
XXX 10E9 拷貝/μL
yw13911392 100 μL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限一年。
自備試劑 樣品等
使用方法 一、樣品 DNA 的制備
用自選方法提取細菌樣品 DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測靈敏度的
關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢
測靈敏度。
二、制備 stn 標準曲線（以 10-10E6 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃
度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本
試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供
活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 DNA 片段作為陽
性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（好用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到
10E7 拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至 10E7
拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。
4. 在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震
蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。
5. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 溶液到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5
拷貝/μL 的陽性對照。
6. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 溶液到 4 號管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6
個稀釋度的陽性對照。
7. NC 管中不加任何陽性對照。
8. 從 1-6 號管中分別取 5 μL 和待測樣品一起進行定量 PCR（見下步），每個
樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值，
并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標準曲線。
三、PCR 檢測（20 μL 體系）
1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次）：
成分 樣品 陰性對照 陽性對照
2×qPCR Mix 10 μL 10 μL 10 μL
待測樣品 DNA 模板 1-5 μL 無 無
stn 陽性對照，XXX 10E9 拷貝/
μL
無 無
5 uL（每個
管加一個
稀釋度的
對照）
自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 2 μL
stn 專一性引物對 2 μL 2 μL 2 μL
補水到 20 μL
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR
儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、
RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。
2. 建議 PCR 反應(yīng)參數(shù)（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）
過程 溫度 時間
預(yù)變性 93℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（40 個循環(huán)）
93℃ 35 s
55℃ 45 s
3. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合
DNA 時，zui大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的zui大吸收光譜在 500 nm，
zui大發(fā)射光譜在 530 nm。
四、數(shù)據(jù)處理
以 stn 陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再
以待測樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值計算出
樣品 DNA 的濃度。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 鸚鵡熱衣原體熒光定量 PCR 檢測試劑盒（CAT#:11-3780）