可調(diào)式易錯(cuò)PCR試劑盒

可調(diào)式易錯(cuò)PCR試劑盒易錯(cuò) PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校對(duì)功能的特性，在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、Mg 濃度和 MnCl2存在）能夠按較高
的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法，則可從構(gòu)建的突變庫(kù)選出所需突變
體。易錯(cuò) PCR 和常規(guī) PCR 的比較如下：
可調(diào)式易錯(cuò)PCR試劑盒是在本公司的易錯(cuò) PCR 試劑盒基礎(chǔ)上改進(jìn)而得，本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，十分簡(jiǎn)單方便，尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的*性。
2. 配方經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)人員在一定范圍內(nèi)可以控制突變率，一輪 PCR 的突變率
范圍在 2-8 突變/1000bp，更高的突變率可以通過(guò)多輪 PCR 達(dá)到。
3. 可用于連續(xù)易錯(cuò) PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯(cuò) PCR
的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò) PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要
的有益突變。
4. 可以擴(kuò)增的 DNA 片段更長(zhǎng)，達(dá)到 3kb，對(duì)于 3kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 100 次塑料袋包裝
Taq DNA 聚合酶（5U/uL） 51206 100 uL
易錯(cuò) PCR Mix 2.0，10× 160903A 300 uL
易錯(cuò) PCR dNTP 2.0，10× 160903B 300 uL
易錯(cuò) PCR MnCl2 160903C 300 uL
易錯(cuò) PCR dGTP 160903D 300 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期為一年。 
自備試劑 引物、DNA 模板。
使用方法 1. 將模板 DNA 稀釋到 1ng/uL。將引物稀釋到 10uM。注意：引物是決定易錯(cuò) PCR
成敗的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)引物時(shí)要保證其 Tm 在 70℃，長(zhǎng)度在 25-30nt 之間，GC
含量在 45%-60%之間，3 端 GC 含量低，并且沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
2. 根據(jù)每 1000bp 的預(yù)期突變數(shù)按下表確定易錯(cuò) PCR 的反應(yīng)條件中 MnCl2和 dGTP
的用量。表中的 A 表示易錯(cuò) PCR 的 MnCl2
, B 表示易錯(cuò) PCR 的 dGTP：
預(yù)期突變數(shù) 2 個(gè) 3 個(gè) 4 個(gè) 5 個(gè) 6 個(gè) 7 個(gè) 8 個(gè)
A 的用量（uL） 0 1.0 2.5 4.0 4.0 4.0 4.0
B 的用量（uL） 0 0 0 1.0 2.0 3.0 4.0
3. 以 30 uL 的標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系為例，如果反應(yīng)體系不是 30 uL，各成分需要按等
比例增加或減少。在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分（注意：可以先計(jì)算出超
純水的用量，優(yōu)先加水）：
成分 用量
超純水 根據(jù)第 2 步加
易錯(cuò) PCR Mix, 10× 3 uL
易錯(cuò) PCR dNTP, 10× 3 uL
易錯(cuò) PCR MnCl2 根據(jù)上步
易錯(cuò) PCR dGTP 根據(jù)上步
自備 DNA 模板（1 ng/uL） 1 uL
自備 PCR 引物(10 uM each) 1 uL each
Taq DNA 聚合酶（5U/uL） 1 uL

4. 按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 條件進(jìn)行一定循環(huán)數(shù)的 PCR（循環(huán)數(shù)與突變率的關(guān)系見(jiàn)下表），
然后取 5 uL 電泳檢查。如果沒(méi)有優(yōu)化的 PCR 條件，一般可以先嘗試下面的 PCR
條件(對(duì) 1Kb 長(zhǎng)的模板而言)：
PCR 前變性 94℃ 3 分鐘
易錯(cuò) PCR(循環(huán) 30 次)
94℃ 1 分鐘
45℃ 1 分鐘
72℃ 1 分鐘
注：易錯(cuò) PCR 一般不需要熱啟動(dòng)，也不需要在 PCR 結(jié)束后做延伸處理。長(zhǎng)度每增
加 1Kb，時(shí)間延長(zhǎng) 1 分鐘。易錯(cuò) PCR 循環(huán)次數(shù)決定每個(gè)核苷酸位置的突變幾率，進(jìn)而
決定每個(gè) PCR 產(chǎn)物可能的突變位點(diǎn)數(shù)，所以所需循環(huán)數(shù)由客戶根據(jù)需要改動(dòng)。
5. 電泳檢測(cè)是否得到預(yù)計(jì)長(zhǎng)度的 PCR 產(chǎn)物。
6. 克隆片段進(jìn)行功能篩選、或者克隆后進(jìn)行測(cè)序分析突變率、或者用此輪 PCR 的產(chǎn)
物為模板，進(jìn)行下一輪的易錯(cuò) PCR。
疑難解答
Q：現(xiàn)象：沒(méi)有 PCR 產(chǎn)物。
A：可能原因：一是引物沒(méi)有優(yōu)化，可以重新設(shè)計(jì)引物；二是模板 DNA 太少，可以增加
用量；三是模板不純，zui先膠回收；四是溶解 DNA 的溶液中有 EDTA，降低了
PCR 反應(yīng)體系的 Mg 離子濃度，可以適當(dāng)補(bǔ)加 Mg 離子。
Q：現(xiàn)象：太多的 PCR 條帶或 PCR 條帶模糊一片。
A：可能原因：一是 PCR 循環(huán)數(shù)太多；二是復(fù)性溫度太低；三是延伸時(shí)間太長(zhǎng)；四是引
物沒(méi)有優(yōu)化，可以重新設(shè)計(jì)引物；五是 PCR 條件沒(méi)優(yōu)化，可以使用 touch-down
PCR；六是模板有其他 DNA 污染；七是 DNA 模板質(zhì)量不高或者濃度太高。
Q: 如果需要更高的突變率，如何辦？
A: 可以使用連續(xù)多次易錯(cuò) PCR 來(lái)提高突變率。但zui先用膠純化回收 PCR 片段,再用
于下一輪易錯(cuò) PCR。此外不能用少于千分之一的*次 PCR 產(chǎn)物作為第二輪易錯(cuò)
PCR 的模板，否則多樣性將受到影響。第三輪易錯(cuò) PCR zui使用所有第二輪的 PCR
產(chǎn)物作為模板，但需要在 10mL 體系中完成（可以分成很多 100uL 體系進(jìn)行）。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 易錯(cuò)PCR試劑盒（CAT#:101005-100）