即用型熒光定量PCR試劑盒

即用型熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)品是基于熒光染料檢測的即用型 PCR 試劑盒，可以對基因組 DNA 靶
序列和 RNA 反轉(zhuǎn)錄后 cDNA 靶序列進行實時定量 PCR 分析（quantitativePCR、qPCR）。

即用型熒光定量PCR試劑盒本產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、優(yōu)化的 Taq DNA 聚合酶、
dNTPs、MgCl2、SYBR Green I 和穩(wěn)定劑等成分。本產(chǎn)品中優(yōu)化的 Taq DNA
Polymerase 高溫加熱前，抗 Taq 單克隆抗體與 Taq 結(jié)合，抑制 Taq 聚合酶活
性，從而抑制在低溫條件下出現(xiàn)的由引物和模板 DNA 之間的非特異性雜交或引
物二聚體引起的非特異性擴增。而且抗體在 PCR 反應的預變性步驟中能*失
活，不會阻礙之后 Taq DNA 聚合酶的活性，大大提高了 PCR 反應的靈敏度及
特異性。
1. 方便，用戶只需準備模板和引物既可以進行實時定量 PCR 實驗。
2. 使用抗 Taq 抗體封閉的優(yōu)化的 Taq DNA 聚合酶，可抑制低溫條件下的非特
異性擴增。
3. 使用第三代飽和型熒光染料，信號強，不會抑制 PCR 反應。
4. 快捷，即用型的預配液使加樣操作步驟大大簡化，避免了交叉污染，降低實
驗誤差。
5. 各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應的靈敏度高，特異性強。能檢測
到濃度為 50 拷貝/mL 的靶分子。
規(guī)格及成分 成分 編號 1 mL 包裝 6 mL 包裝
qPCR MagicMix，2× 90408 1 mL（棕色管） 6×1 mL（棕色管）
使用手冊 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存, 保存期限為 6 個月。
自備試劑 DNA 模板、引物、超純水。
使用方法 1. 以 20 uL 的 qPCR 反應體系為例：在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分：
反應體系成分 20 uL 體系 終濃度
qPCR MagicMix，2× 10 uL 1×
自備引物一 a x uL 0.1-0.5 uM
自備引物二 a x uL 0.1-0.5 uM
自備模板 a x uL
自備 ROXb 2 uL （可以不加）
補超純水到 20 uL
放入熒光 PCR 儀中進行擴增, 并在退火或延長步驟中記錄熒光信號。
注意：
a) 通常引物濃度以 0.2 μM 可得到較好結(jié)果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作
為設(shè)定范圍的參考；通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因組 DNA 或
1-10 ng cDNA 為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不
同，可對模板進行梯度稀釋，以確定*的模板使用量。
b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三種型
號的熒光 PCR 儀器，則需用自備的 ROX 進行 Ct 值校正。對 ABI 7700
和 7900，ROX 的*濃度為 1×（即在每 20 uL 反應體系中加 2 uL
10×ROX）。對 ABI 7500， ROX 的*濃度為 0.05-0.1×（每 20
uL 反應體系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可將 10×ROX 稀釋到 1×，
然后每個反應體系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX 會在溶解曲線中產(chǎn)生
噪音，因此，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”
中的“ROX”選項取消打勾，然后重新分析數(shù)據(jù)。
對于 iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000,
RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號的
熒光 PCR 儀器，ROX 不是必須的，但加入的話也不會影響整個 PCR
分析。
2. 循環(huán)步驟：根據(jù)擴增子的性質(zhì)和儀器性能，從以下三個過程中任選一個進行
擴增。
A：兩步快速循環(huán)法：適用于引物 Tm 值設(shè)計為 60℃的反應
循環(huán)步驟 溫度 時間 循環(huán)數(shù)
酶活化 95℃ 2-5 min 1
變性
退火&延伸
95℃
60℃
15 s
1 min
35-40
注意：本產(chǎn)品所采用的酶在預變性 95℃、2-5 min 條件下實現(xiàn)酶的活化。
退火溫度請以 60-64℃作為設(shè)定范圍的參考，發(fā)生非特異性反應時，可適當
提高退火溫度。
B：三步快速循環(huán)法：適用于延伸步驟溫度高于退火步驟的 PCR（長引物
PCR）
循環(huán)步驟 溫度 時間 循環(huán)數(shù)
酶活化 95℃ 2-5 min 1
變性
退火
延伸
95℃
56-64℃
72℃e
15 s
30 s
30 s
35-40
注意：退火溫度：建議采用兩步法 PCR，退火溫度 60℃進行反應。若提高
反應特異性，可提高退火溫度，以 60-64℃作為設(shè)定范圍的參考。若因使用
Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR
擴增，三步法的退火溫度請以 56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考。延伸溫度：
延伸溫度設(shè)為 72℃通常可以提高擴增效率。但是，對于 AT 含量大于 70%
的擴增子來說，延伸溫度設(shè)為 60℃為宜。
C：通用循環(huán)法：這種循環(huán)方法適用于幾乎所有的熒光 PCR 儀，也適用于用
快速循環(huán)法不能擴增的模版。
循環(huán)步驟 溫度 時間 循環(huán)數(shù)
酶活化 95℃ 5 min 1
變性
退火&延伸
95℃
60℃
15 s
60 s
35-40
3. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在沒結(jié)合
DNA 時，zui大吸收光譜在 471nm，結(jié)合 DNA 時的zui大吸收光譜在 500nm，
zui大發(fā)射光譜在 530nm。
注意事項 1. 如果使用 iCycler，可以不加入 FAM。
2. 如果使用 Roche LightCycler 的玻璃毛細管進行 PCR，需加入終濃度為
0.5mg/mL 的自備 BSA。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 即用型 PCR2.0、PCR 級綠如藍染料。