布魯氏菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）

布魯氏菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品及特點 布魯氏菌（brucellosis）為病原微生物，是一種細(xì)胞內(nèi)寄生小球桿狀菌，革蘭氏染色陰性，主要感染牛、羊、豬、狗以及駱駝、鹿等動物。布魯氏菌主要是通過接觸感染的動物或者吃被感染的食物以及實驗室接觸等方式傳播給人類，
能引起人和多種動物的急性和慢急性疾病，被感染的人和動物表現(xiàn)為流產(chǎn)及等癥狀。
布魯氏菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合 Taqman 技術(shù)，對布魯氏菌的
特異性 DNA 核酸片段進(jìn)行熒光檢測，可用于臨床對布魯氏菌的輔助診斷，使用
方便，即開即用。血液、骨髓、關(guān)節(jié)腔液及病畜的組織、奶、奶制品均可作為本
試劑盒的檢測標(biāo)本。標(biāo)本可立即用于檢測，也可保存在-20℃待測。標(biāo)本運送應(yīng)
在低溫條件下進(jìn)行。
規(guī)格及成分 成分 編號 25 次塑料袋包裝
核酸提取液 11-4505A 1.5 mL×2
熒光 PCR Mix 11-4505B 950 μL
酶（Taq+UNG） 11-4505C 12 μL
超純水 100935 400 μL
內(nèi)部對照品 11-4505D 30 μL
陽性對照品 11-4505E 30 μL
使用手冊 1 份
運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限一年。
自備試劑 Hank’s 液（PBS 或生理鹽水）、血液分離液
使用方法 一、標(biāo)本、對照品的核酸裂解處理
1. 骨髓、關(guān)節(jié)腔液、血清等液態(tài)標(biāo)本：取 50 μL 樣本，加入 50 μL 核酸提取
液充分混勻，沸水浴 10 分鐘，然后 13,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清 4
μL 作為 PCR 反應(yīng)模板。
2. 全血 PBMC 分離：取抗凝血 1 mL，與 Hank’s 液（PBS 或生理鹽水）1：
1 混勻后，小心加于 2 mL 的細(xì)胞分離液的液面上，2000 rpm 離心 15 分
鐘（半徑 15 cm 水平轉(zhuǎn)子），收集界面上的細(xì)胞（中間呈白色層），置于 1.5
mL eppendorf 管中，2000 rpm 離心 10 分鐘，棄上清液。沉淀中加入
50 μL 核酸提取液，振蕩 10 秒，99℃干浴或水浴 10 分鐘，13,000 rpm
離心 10 分鐘，保留上清備用。
3. 奶標(biāo)本：取奶 3 mL ，13,000 rpm 離心 2 分鐘；棄去上清，沉淀中直接
加入 100 μL DNA 提取液充分混勻，沸水浴 10 分鐘（誤差不超過 1 分鐘）。
13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清 4 μL 做 PCR 反應(yīng)。
4. 超純水作為陰性對照。如進(jìn)行定量檢測，陽性對照品（1×107
copies/mL）需
要進(jìn)行 10、100、1000 倍梯度稀釋。
二、試劑配制
取 n×35 μL 熒光 PCR Mix 與 n×1 μL 內(nèi)部對照品，以及 n×0.4 μL 酶
（Taq+UNG）（n 為反應(yīng)管數(shù)），振蕩混勻數(shù)秒，3000 rpm 離心數(shù)秒。（備注：
如不使用內(nèi)部對照品，可用 n×1 μL 的超純水代替補(bǔ)足。）
三、加樣
取上述混合液 36 μL 置于薄壁 PCR 反應(yīng)管或 PCR 反應(yīng)板中，然后將已處
理標(biāo)本、陽性對照品、超純水各 4 μL 分別加入薄壁 PCR 反應(yīng)管或 PCR 反應(yīng)板
中，蓋好薄壁 PCR 反應(yīng)管蓋或 PCR 反應(yīng)板膜，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
四、PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)管置于定量熒光 PCR 儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：
過程 溫度 時間
37℃ 2 分鐘
預(yù)變性 94℃ 2 分鐘
PCR 反應(yīng)
（40 個循環(huán)）
93℃ 15 s
60℃ 60 s
 單點熒光檢測在 60℃。反應(yīng)體系 40μL。
熒光通道檢測選擇：選用 FAM 和 HEX （或 VIC/JOE）通道。
備注：如使用 ABI 系列 PCR 儀，請務(wù)必于 passive reference 和 quencher
處均選擇“none”。
五、基線和閾值設(shè)定
基線調(diào)整取 6-15 個循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過超純
水檢測熒光曲線的zui高點。
n×35 μL 混合液 + n×1 μL 內(nèi)對照+ n×0.4 μL 酶
n×36 μL分裝 加 4 μL 模板
上機(jī)
+
六、校準(zhǔn)程序
進(jìn)行定量檢測時需要進(jìn)行校準(zhǔn)程序，陽性對照品處理和加樣在使用方法的一
和二中已經(jīng)說明；實驗結(jié)束后將陽性對照品濃度輸入儀器軟件中，儀器自動生成
標(biāo)準(zhǔn)曲線。
七、實際結(jié)果的判斷
通道 Ct 值 結(jié)果判斷
FAM UNDET 或 40 樣本低于檢測限，報告為陰性
FAM ≤38 報告為陽性
FAM 38~40 復(fù)檢一次，如仍為 38~40，則報告為陰性
進(jìn)行定量檢測時，儀器生成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，自動顯示待測樣品定量值。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 豬、牛、羊布魯氏菌病 PCR 檢測試劑盒（CAT#:11-130）
 20151117xh

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