產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）

產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）產(chǎn)品及特點 產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起人類食物中毒和抗生素相關性腹瀉等, 廣泛存在于自然界的土壤、水源及人和動物腸道中。目前根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的4 種重要的致病性毒素（α、β、ε、ι 毒素）能力, 可將其分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）和E（α、ι）型

產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）產(chǎn)品及特點 產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起人類食物中毒和抗生素相關性腹瀉等, 廣泛存在于自然界的土壤、水源及人和動物腸道中。目前根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的4 種重要的致病性毒素(α、β、ε、ι 毒素)能力, 可將其分為A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)型, 各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均含有α-毒素(CPa)基因。LAMP 等溫
擴增（環(huán)介導等溫擴增）利用4條模板專一的特異引物和具有鏈置換能力的DNA
聚合酶，在等溫條件下(63℃左右) 30-60分鐘完成擴增。該技術在靈敏度、特異
性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于 PCR 技術，同時還不需要模板的熱變
性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，不依賴任何專門的儀器設備。本產(chǎn)品即
是針對產(chǎn)氣莢膜梭菌 CPa 基因設計的LAMP特異引物組，采用環(huán)介導等溫擴增
法結合熒光染料顯色的體外擴增檢測技術，適用于溶血性鏈球菌核酸的快速檢
測。

產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）本試劑盒具有下列特點：
1. 高特異性，由于同時使用 4-6 條特異引物，所以特異性比 PCR 更高。
2. 高擴增效率，擴增效率可達到 10E9-10E10，比 PCR 靈敏一個數(shù)量級，可
檢測到單拷貝的 DNA 分子
3. 65℃左右等溫擴增，不需要貴重的熱循環(huán)儀。
4. 即開即用，包含了除引物和模板 DNA 外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼檢測擴增結果，不需要昂貴的電泳、熒光 PCR 等儀器。
6. 提供擴增對照，便于在遇到困難時分析原因。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 50 次包裝
LAMP Mix（2×） 11-180405a 0.5 mL
Bst DNA 聚合酶(8U/uL) 100209 75 uL
對照引物 11-180405b 40 uL
對照模板 DNA 11-180405c 5 uL
25 mM MgCl2 90302 0.2 mL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 11-180405sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑 模板及引物
使用方法 1. 在冰上溶解除酶外的各種組份，混勻，稍離心。在反應管中加入以下組份：
成份 樣品管 陰性對照
LAMP Mix（2×） 10 uL 10 uL
FIP 引物終濃度 0.8 uM 0.8 uM
BIP 引物終濃度 0.8 uM 0.8 uM
F3 引物終濃度 0.2 uM 0.2 uM
B3 引物終濃度 0.2 uM 0.2 uM
Loop F 引物終濃度（可選項） 0.4 uM 0.4 uM
Loop B 引物終濃度（可選項） 0.4 uM 0.4 uM
MgCl2（25 mM） 3 uL 3 uL
模板 DNA 1-100ng 不加
Bst DNA 聚合酶(8U/uL) 1.5 uL 1.5 uL
補水到 20 uL 20 uL
注：如在反應管中加入本公司PCR級綠如藍染料1uL（水則少加1 uL），則可
直接在熒光定量PCR儀中進行熒光定量檢測。
2. 混勻，置于60-65℃保溫30-120分鐘。注意：如果不使用Loop引物，則zui
保溫2小時；如果使用Loop引物，則zui保溫30分鐘。
3. 80℃10分鐘滅活Bst DNA聚合酶。
4. 產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆没蛄⒓从糜谙掠螜z測。擴增產(chǎn)物可選下列方法之一檢測:
1) 瓊脂糖凝膠電泳。取擴增產(chǎn)物5 uL，1-2%的瓊脂糖凝膠電泳，可見
LAMP特征性電泳圖譜；
2) 向擴增產(chǎn)物中直接加入本公司PCR級綠如藍染料（另售）1 uL，混勻，
稍離心。將反應管置于紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)中，紫外燈下可見綠
色熒光產(chǎn)生；
3) 熒光定量檢測。
5. 結果分析：
1) 如果沒有擴增，則需要用本試劑提供的陽性對照進行擴增。本試劑盒提
供5次陽性對照，反應按下表設置：
成份 陰性對照管 陽性對照管
LAMP Mix（2×） 10 uL 10 uL
對照引物混合物 4.0 uL 4.0 uL
對照模板 DNA 不加 1 uL
MgCl2（25 mM） 3 uL 3 uL
Bst DNA 聚合酶(8U/uL) 1.5 uL 1.5 uL
水 1.5 uL 0.5 uL
混勻后，置于60℃保溫120分鐘，其余操作同上。注意：本對照引物中
沒有Loop引物，所以zui保溫2小時。
如果陽性對照能夠擴增出，則說明試劑盒沒有問題，可能是模板或引物的
問題。如果陽性對照沒有擴增出條帶，則是試劑盒的問題，請跟廠家。
注意事項 注意事項：
1. 引物設計對成功擴增十分關鍵。除用于 SNP 分型外，盡量以保守區(qū)設
計引物。
2. 引物至少包括 F3/B3 和 FIP/BIP，加入環(huán)狀引物 F loop/B loop 可
以使反應速度大大提高。
3. 應優(yōu)化引物序列、GC 含量和盡量避免二級結構。
4. 反應中各個引物的濃度及比例對擴增效果有一定的影響。
5. 建議先將所有引物混合在一起，配制成 10?濃度以方便使用。
6. LAMP 擴增具有特異性好、靈敏度高、時間快、不需要特殊儀器設備
等優(yōu)點。但太高的靈敏度使得其比普通 PCR 擴增更加容易污染導致假
陽性。因此，必須高度重視擴增產(chǎn)物的污染。常規(guī)措施包括嚴格的實驗
分區(qū)、添加 UNG 和 dUTP（可能導致反應效率下降）、使用熒光定量
等不開蓋檢測方法。實驗室一旦遭到污染，所有相關試劑必須全部更換，
必要時還得更換實驗室。
7. 要確證擴增的為目標基因，可以使用特定的限制性酶切和 /或
Southern 雜交。
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品等用途。
關聯(lián)產(chǎn)品 Bst DNA 聚合酶(CAT#:100209-800)
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