顯微課堂 | 如何形成清晰的圖像

DIN/ISO標(biāo)準(zhǔn)將物體側(cè)面的景深定義為“物體平面兩側(cè)空間的軸向深度，物在該深度范圍內(nèi)移動時沒有可檢測到的圖像清晰度損失，且圖像平面和物鏡的位置保持不變"。

然而，該標(biāo)準(zhǔn)沒有給出任何關(guān)于焦點虛化檢測閾值的測量方法。Max Berek是就人眼景深發(fā)表文章的作者，早在1927年，他就已經(jīng)將自己通過廣泛實驗獲得的結(jié)果公布于世。Berek公式給出了人眼景深的實際值，至今仍在沿用。簡化公式如下：

TVIS = n [λ/(2 × NA2) + 340 μm/(NA × MTOT VIS)]

在放大率低時，縮小光圈（即減小數(shù)值孔徑）可以顯著延長景深。一般可用孔徑光闌或共軛平面上的光闌來完成這一操作。但數(shù)值孔徑越小，橫向分辨率越低。

因此，問題在于如何根據(jù)物體結(jié)構(gòu)找到分辨率和景深之間的最佳平衡點。借助高分辨率物鏡（高NA）和可調(diào)孔徑光闌，現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡能夠根據(jù)特定樣品的要求靈活匹配光學(xué)器件。在體視顯微鏡中，考慮到三維結(jié)構(gòu)中z維度的要求，通常需要作出一些妥協(xié)以獲得更大景深。

Leica Microsystems采用了一種復(fù)雜的光學(xué)方法來消除體視顯微鏡中分辨率和景深之間的相關(guān)性，這種方法就是FusionOptics™。該設(shè)備提供了一條光路方便觀察者單眼觀察分辨率高但景深短的圖像。另一只眼可通過第二條光路觀察到同一物體，但此時分辨率低而景深長。

人腦將兩個獨立的圖像組合成一個最佳的整體圖像，即同時具有高分辨率和長景深的特征。

還有一個示例也闡明了人腦的非凡能力，即Greenough體視顯微鏡。在這個顯微鏡中，左光路和右光路中的物體平面之間存在微小角度。在整個圖像中，整個陰影區(qū)域看起來是清晰聚焦的，但左圖像或右圖像中的并非如此。

圖2：具有景深范圍的Greenough體視顯微鏡中的物體平面

Leica應(yīng)用程序組（LAS X）的多聚焦模塊旨在多次通過多次聚焦來增加自動顯微鏡的景深。用戶可以單獨設(shè)置照明、圖像亮度和所有其他相機參數(shù)，以優(yōu)化所獲圖像的質(zhì)量。

利用LAS X多聚焦模塊，在顯微鏡和主動對焦的一體化控制下，可以輕松捕獲具有更大景深的實時圖像。z堆棧的自動捕獲以及智能圖像組合算法確?？梢暂p松拍攝并存儲清晰的聚焦圖像。

由于存在自動化處理例行程序，用戶幾乎無需干預(yù)?？舍槍Ω鞣N樣品輕松更改此類設(shè)置。多聚焦模塊適用于材料科學(xué)、法醫(yī)學(xué)以及生物和地球科學(xué)方面的應(yīng)用程序。