圖1 抗體純化工藝流程

一話 離心、過(guò)濾

抗體為胞外分泌型表達(dá)，純化的一步是將培養(yǎng)液上清與細(xì)胞及細(xì)胞碎片分離開來(lái)。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，分離可通過(guò)簡(jiǎn)單批次離心完成，但大規(guī)?？贵w生產(chǎn)主要采用連續(xù)分離的方法，主要包括深層過(guò)濾、切向流過(guò)濾和連續(xù)流離心。

深層過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易用，前期投入低。深層過(guò)濾介質(zhì)的孔徑分布較廣，內(nèi)表面積大，可依靠孔徑截留和內(nèi)表面吸附雙重作用去除固體顆粒，比單一孔徑濾器能處理更的固體雜質(zhì)，且流速更快。

深層過(guò)濾系統(tǒng)由一系列的濾器組成，介質(zhì)的孔徑從上游到下游遞減（見(jiàn)圖2）。深層過(guò)濾本身不能達(dá)到無(wú)菌過(guò)濾，所以過(guò)濾系統(tǒng)的后通常需要一個(gè)無(wú)菌濾器。深層過(guò)濾介質(zhì)中含有硅藻土，硅藻土在抗體純化條件下帶正電荷，在去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片的情況下，還可以去除部分帶負(fù)電荷的宿主細(xì)胞核酸和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，起到初步純化的作用。

深層過(guò)濾的缺陷是一次性濾芯使用費(fèi)用高和處理量有限，在處理大體積培養(yǎng)液時(shí)需并聯(lián)多個(gè)濾器，費(fèi)用和占地面積顯著增加，所以深層過(guò)濾的試用范圍限于100-2000L的中試規(guī)模的抗體純化。

圖2 深層過(guò)濾系統(tǒng)切面圖

切向流濾器在灌流反應(yīng)器部分較為常用（見(jiàn)圖3），其高切向的流速可減少細(xì)胞在膜表面的沉積，從而可以處理大體積細(xì)胞培養(yǎng)液而不造成膜的堵塞。

切向流的流速越高，細(xì)胞沉積越少，但同時(shí)帶來(lái)的剪切力越高，細(xì)胞破碎風(fēng)險(xiǎn)越大。細(xì)胞破碎形成的細(xì)胞碎片更容易阻塞濾芯，并且細(xì)胞破碎釋放的胞內(nèi)蛋白和核酸將大大增加后續(xù)純化步驟的壓力。

切向流濾器的使用以中空纖維普遍，其表面積大，又可以在孔腔內(nèi)形成高剪切力。中空纖維濾器的工藝放大可通過(guò)增加纖維數(shù)目完成，簡(jiǎn)單易行。

在切向流過(guò)濾工藝開發(fā)和優(yōu)化方面，需要考慮的包括濾芯化學(xué)成分、濾芯表面積、孔徑、切向流流速、跨膜壓力。

切向流過(guò)濾存在死體積，可在過(guò)濾后期加人少量緩沖液，降低死體積中的抗體含量，減少抗體損失。切向流過(guò)濾處理量大，可用于超過(guò)10000L細(xì)胞培養(yǎng)的分離，達(dá)到每小時(shí)近5000L的液體處理量。其局限在于濾器費(fèi)用較高，過(guò)濾時(shí)間較長(zhǎng)，并且過(guò)濾速度的可控性低。

圖3 切向流濾器切面圖

連續(xù)流離心，尤其是采用碟片式離心機(jī)進(jìn)行的連續(xù)流離心，是大規(guī)?？贵w生產(chǎn)中主要采用的分離模式。

碟片式離心機(jī)腔體為錐形，細(xì)胞培養(yǎng)收獲液在靠近軸部加入，離心后上清液從軸部附近排出，細(xì)胞在離心力作用下，在錐形的底部邊線附近聚集結(jié)塊。

腔體定期在細(xì)胞聚集處輕微開啟，利用腔體內(nèi)的壓力將細(xì)胞排出。細(xì)胞排出夾帶的液體損失可通過(guò)離心力（轉(zhuǎn)速）、腔體開啟頻率和開啟時(shí)間的優(yōu)化，控制在5%以下。

連續(xù)流離心能夠去除絕大部分細(xì)胞和細(xì)胞碎片。殘留的少量細(xì)胞碎片可用深層過(guò)濾去除。碟片式離心機(jī)的優(yōu)點(diǎn)是體積小，多層碟片形成的沉降面積大，液體處理量大，操作簡(jiǎn)單、可靠，使用費(fèi)用低。其缺點(diǎn)是前期設(shè)備投資髙，清洗較復(fù)雜，并缺少合適的小試模型。