文章來源：生物屋，作者：屋中人

[細(xì)胞因子概述]

根據(jù)其作用，細(xì)胞因子也可分為促炎性或抗炎性，促炎細(xì)胞因子包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、TNF-α、IFN-γ和 TGF-β等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)并傾向于刺激免疫活性細(xì)胞。相反，抗炎細(xì)胞因子，如 IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、IL-1受體拮抗劑 (IL-1RA)和 TGF-β，可抑制炎癥并抑制免疫細(xì)胞。一些細(xì)胞因子(例如 IL-6、IL-11、TGF-β)具有促炎和抗炎特性。

·單一細(xì)胞因子可能由不同細(xì)胞分泌，并且根據(jù)具體情況具有促炎或抗炎活性，從而產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間動(dòng)態(tài)且不斷變化的平衡通過介導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥在宿主免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，促炎性細(xì)胞因子有助于自身免疫性炎癥的引發(fā)和傳播，而抗炎性細(xì)胞因子則有助于炎癥的消退和自身免疫性疾病急性期的恢復(fù)。

考慮到先天免疫和適應(yīng)性免疫，促炎和抗炎細(xì)胞因子對(duì)免疫細(xì)胞分化、炎癥、血管生成、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)生物學(xué)、病毒發(fā)病機(jī)制、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥和衰老都具有重要的生物學(xué)和臨床意義。

表 2說明了與各種細(xì)胞因子相互作用相關(guān)的不同典型疾病，這支持了細(xì)胞因子作為多種自身免疫和炎癥疾病的生物標(biāo)志物的模型。

[影響生物體液中細(xì)胞因子定量的因素]

血樣處理對(duì)細(xì)胞因子穩(wěn)定性的影響

o 已知大多數(shù)細(xì)胞因子在體內(nèi)的半衰期很短(表 1)，并且在樣品收集和制備過程中會(huì)快速降解，如果不采用適當(dāng)?shù)难禾幚沓绦颍@會(huì)導(dǎo)致假陰性信號(hào)。

o 血清和血漿源自全血，并在采血后進(jìn)行不同的處理方式。血清是凝固血液的可溶部分，是血液凝固后獲得。在凝塊形成過程中，血細(xì)胞可能會(huì)被激活，細(xì)胞因子可能會(huì)從血小板釋放到血清中(例如 IL-1、IL-6 和 IL-8)。

o 血漿是抗凝血液的可溶部分，在從全血中分離血漿之前，白細(xì)胞可以在體外分泌細(xì)胞因子并改變血漿中細(xì)胞因子的水平。為了獲得血漿，在去除血細(xì)胞之前可以使用各種抗凝劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素鋰/鈉，從而抑制凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。

o 研究表明，使用各種抗凝劑、內(nèi)毒素管污染和血液處理(離心)延遲會(huì)對(duì)血漿或血清中的細(xì)胞因子濃度產(chǎn)生重大影響，并可能導(dǎo)致細(xì)胞因子測(cè)量值錯(cuò)誤地增加或減少。例如，肝素(全血處理中的抗凝劑)可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子；肝素鋰和檸檬酸鈉被證明會(huì)影響 IL-6 和 TNF-α的水平，這可能歸因于抗凝劑誘導(dǎo)的血細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，特別是在肝素血漿中，但在 EDTA 血漿中則不然。

o Friebe和Volk報(bào)道了血液樣本中TNF-α 、IL-6和IL-8的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)肝素血漿和血清中TNF-α和IL-8的水平增加，但它們?cè)贓DTA血漿中的濃度穩(wěn)定。相比之下，所有血型的 IL-6 水平在 8 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。與血漿中的細(xì)胞因子水平相比，血清中較高的細(xì)胞因子水平表明凝血過程促進(jìn)了細(xì)胞因子的釋放，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致。使用 EDTA 采集血漿似乎能帶來最一致的結(jié)果，并且更接近于血清中獲得的數(shù)據(jù)。總之，EDTA 血漿似乎細(xì)胞因子測(cè)量，主要是出于穩(wěn)定性原因。

o 此外，盡管血液采集和到達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)試之間總是存在時(shí)間間隔，但通常建議快速制備樣品。

樣品儲(chǔ)存對(duì)細(xì)胞因子穩(wěn)定性的影響

o 為了獲得可靠的結(jié)果，許多研究檢查了儲(chǔ)存對(duì)血液中細(xì)胞因子水平的影響。

o Cohen等評(píng)估了樣品儲(chǔ)存對(duì)血漿中 IL-6、IL-10、IFN-γ和 IL-2 測(cè)量的影響，全血在室溫下儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子水平降低，但全血在 4°C 下儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子穩(wěn)定性。

o Vincent等最近評(píng)估了血清冷凍前儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)細(xì)胞因子穩(wěn)定性的影響，并將結(jié)果與從系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE) 患者獲得的血漿樣本進(jìn)行了比較。在這項(xiàng)研究中，患者的血清和血漿樣本在冷凍前預(yù)先在 4°C 下儲(chǔ)存 0-30 天的預(yù)定時(shí)間，幾乎所有分析的細(xì)胞因子(12 種中的 11 種)在冷凍前在 4°C 下保存長(zhǎng)達(dá) 30 天時(shí)都是穩(wěn)定的，只有單一分析物趨化因子(C-C 基序)配體 19 (CCL19) 從 4 °C 儲(chǔ)存的第4天起顯示出顯著的信號(hào)衰減。與血漿相比，大多數(shù)分析物在未分離的血清中的細(xì)胞因子水平更穩(wěn)定，但 IL-37 除外，它在血漿中似乎稍微更穩(wěn)定，本研究建議未分離的血清樣品在 4 °C 下最多可保存 3 天。

o Valaperti 等研究表明許多細(xì)胞因子在室溫下采集樣品后可以在短時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，建議快速處理和冷凍新鮮采集的全血樣本，以避免假陽性結(jié)果。

o Panicker 等研究了在采集宮頸粘液時(shí)速凍和冷藏的效果，TNF-α、IFN-γ和 IL-1β在冷藏樣品之間存在顯著差異，顯示每種細(xì)胞因子的水平較高，這一發(fā)現(xiàn)表明在收集后立即冷藏粘液樣本可以更好地保存宮頸粘液中的細(xì)胞因子。

凍融對(duì)細(xì)胞因子穩(wěn)定性的影響

o Simpson等總結(jié)了樣品在不同溫度下儲(chǔ)存或暴露于重復(fù)凍融循環(huán)時(shí) 33 種細(xì)胞因子的穩(wěn)定性，由于通常使用預(yù)先解凍的樣品，因此凍融穩(wěn)定性評(píng)估是細(xì)胞因子測(cè)量的一個(gè)重要考慮因素。

o 經(jīng)過多次凍融循環(huán)后，細(xì)胞因子的水平可以穩(wěn)定、增加或減少，并且每種細(xì)胞因子的水平都不同。一般來說，大多數(shù)細(xì)胞因子在最多3次凍融循環(huán)中保持穩(wěn)定。

o Jae 等評(píng)估了反復(fù)冷凍和解凍對(duì)不同細(xì)胞因子的血漿和血清濃度的影響，在反復(fù)凍融循環(huán)期間，血漿和血清中的 IFN-γ和 IL-8水平保持穩(wěn)定。然而，某些細(xì)胞因子的濃度隨著每個(gè)連續(xù)的凍融循環(huán)而變化，在三個(gè)循環(huán)后變得顯著。

o Henno 等研究了冷凍和解凍對(duì) EDTA 和檸檬酸鹽血漿中細(xì)胞因子穩(wěn)定性的影響，并報(bào)道血漿冷凍和解凍最多3次后細(xì)胞因子水平?jīng)]有顯著變化。然而，冷凍和解凍6次后，EDTA血漿中的 IL-1β水平出現(xiàn)輕微但具有生物學(xué)意義的下降，而 CCL5 水平則有所上升，這表明樣品處理最多進(jìn)行3次凍融循環(huán)，以便進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞因子分析。

o 一般來說，為了保持細(xì)胞因子水平穩(wěn)定以進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量，樣品應(yīng)進(jìn)行最小程度的凍融。

·可溶性細(xì)胞因子受體對(duì)細(xì)胞因子檢測(cè)的拮抗和激動(dòng)作用

o 可溶性細(xì)胞因子受體或細(xì)胞因子結(jié)合蛋白(例如 IL-18 binding protein，IL-18BP)由膜結(jié)合受體的蛋白水解裂解或由細(xì)胞釋放，并出現(xiàn)在生物體液或組織培養(yǎng)上清液中的選擇性剪接 mRNA 的翻譯產(chǎn)生，這些受體作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，在體外對(duì)其各自的細(xì)胞因子具有拮抗作用。

o 有許多例子說明大多數(shù)可溶性細(xì)胞因子受體可以干擾細(xì)胞表面受體并與細(xì)胞表面受體競(jìng)爭(zhēng)游離細(xì)胞因子的結(jié)合，因此細(xì)胞因子受體阻止細(xì)胞因子結(jié)合其特定的膜受體并產(chǎn)生信號(hào)，從而抑制細(xì)胞因子活性。

o 可溶性細(xì)胞因子受體的拮抗作用可能在免疫反應(yīng)的下調(diào)和某些細(xì)胞因子“過度活躍"的抑制中發(fā)揮重要作用。例如，Levine 報(bào)道可溶性 IL-1 受體可以通過優(yōu)先結(jié)合 IL-1β 來減弱過度的 IL-1 生物活性。

o 盡管大多數(shù)可溶性細(xì)胞因子受體具有作為細(xì)胞因子的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的能力，但一些受體可能在體內(nèi)增強(qiáng)其自身細(xì)胞因子的活性或具有與作為載體蛋白的附加作用一致的特性。

o 這種類型的可溶性受體通過與細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基相互作用來增強(qiáng)而不是抑制細(xì)胞因子的活性，從而產(chǎn)生信號(hào)(即可溶性 IL-6 受體 (sIL-6R) 和糖蛋白 130 (gp130))。與可溶性 IL-1 受體對(duì) IL-1 信號(hào)的拮抗作用相反，Levine 報(bào)道了 sIL-6R 對(duì) IL-6 信號(hào)放大的激動(dòng)作用。因此，細(xì)胞因子與其可溶性受體的結(jié)合可以提高細(xì)胞因子的分子穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致活性降低。這一假設(shè)與生物活性 TNF三聚體與可溶性 TNF 受體的結(jié)合減緩其分解為無活性單體的觀點(diǎn)一致，從而導(dǎo)致長(zhǎng)期孵育后生物活性增加。

o 可溶性細(xì)胞因子受體的這些拮抗和激動(dòng)作用可能會(huì)影響細(xì)胞因子的檢測(cè)。一項(xiàng)研究表明，在某些情況下，例如炎癥性疾病，生物體液中可溶性細(xì)胞因子受體的存在可能會(huì)干擾免疫測(cè)定，例如基于微珠的多重免疫測(cè)定和 ELISA。

o 幾種細(xì)胞因子，特別是IL-1β、TNF-α和IL-6，可能與可溶性受體結(jié)合，形成免疫測(cè)定無法識(shí)別的結(jié)合形式。例如，在癌癥患者中，競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定通?？蓹z測(cè)到 TNF-α，但 ELISA 測(cè)定在癌癥患者血漿中未檢測(cè)到TNF-α，這與生物測(cè)定數(shù)據(jù)一致。Engelberts等研究了這些效應(yīng)，并表明與 p55 TNF 受體結(jié)合的TNF-α不能被夾心 ELISA 測(cè)定很好地識(shí)別。

o 此外，就 IL-6 而言，血漿中含有幾種結(jié)合形式的IL-6，分子量范圍為50-150 至 400-500 kDa，與某些抗血清反應(yīng)較差，并且由IL-6與可溶形式的IL-6 受體形成復(fù)合物，這引發(fā)了關(guān)于血漿中 IL-6 實(shí)際濃度的爭(zhēng)議。大多數(shù)免疫測(cè)定發(fā)現(xiàn)正常血漿中IL-6的濃度無法檢測(cè)到或范圍在10-75 ng/L之間，在膿毒癥中水平上升至1-2 µg/L，或者在腦膜炎球菌疾病中甚至是200 µg/L。

o 然而，May等報(bào)道大多數(shù)檢測(cè)僅識(shí)別低分子量的 IL-6，使用識(shí)別高分子質(zhì)量形式的單克隆抗體檢測(cè)，在正常血漿中的 IL-6 濃度為 1-10 µg/L，并且在骨髓移植后患者的血清樣本中，濃度為 5-10 mg/L。

o 因此，有必要確切地知道測(cè)定法正在測(cè)量細(xì)胞因子或細(xì)胞因子復(fù)合物的哪些成分，并且最好應(yīng)考慮可溶性受體的水平。

[細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)]

·Revvity HTRF技術(shù)

o 均相時(shí)間分辨熒光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF)技術(shù)采用夾心分析法檢測(cè)，使用兩種不同的特異性抗體，一種用Eu(供體)標(biāo)記，另一種用d2(受體)標(biāo)記。當(dāng)標(biāo)記的抗體與同一抗原結(jié)合時(shí)，供體用光源(激光或閃光燈)激發(fā)，觸發(fā)向受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，進(jìn)而在特定波長(zhǎng)(665nm)發(fā)出熒光。這兩種抗體與樣本中存在的T細(xì)胞因子結(jié)合，從而產(chǎn)生FRET。信號(hào)強(qiáng)度與形成的抗原-抗體復(fù)合物的數(shù)量成正比，因此也與檢測(cè)的細(xì)胞因子濃度成正比。

o 實(shí)驗(yàn)僅需在空板中加入16μl檢測(cè)樣本，然后加入4μl檢測(cè)抗體孵育2小時(shí)后即可使用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。

o HTRF技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子試劑盒體系中使用相同的buffer和低樣本的需求，所以，實(shí)驗(yàn)允許從同一上清液中平行地定量多種細(xì)胞因子，可同時(shí)檢測(cè)3個(gè)以上的細(xì)胞因子。僅需將樣本加入孔板內(nèi)，依次加入不同檢測(cè)試劑即可實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞因子的檢測(cè)。

Revvity AlphaLISA技術(shù)

o AlphaLISA技術(shù)同樣采用夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子，一個(gè)抗體被生物素化并與鏈霉親和素包被的供體微珠結(jié)合，受體微珠則直接與另一個(gè)抗體結(jié)合。細(xì)胞因子存在的情況下，抗體與細(xì)胞因子結(jié)合使供體和受體微珠靠近，供體微珠的激發(fā)使得單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微珠，從而發(fā)射615nm波長(zhǎng)的光信號(hào)，AlphaLISA的檢測(cè)信號(hào)與樣本中存在的細(xì)胞因子的數(shù)量成正比。

o AlphaLISA技術(shù)是均相體系、操作方便、無洗滌步驟、2h完成檢測(cè)；節(jié)省樣本，樣本需求低至5μl；體系穩(wěn)定，批次間重復(fù)性高；靈敏度高，實(shí)驗(yàn)窗口大，線性范圍寬；高通量，兼容96/384/1536孔板。

·放射免疫分析法 (RIA)

o 放射免疫分析法對(duì)生物樣品中的細(xì)胞因子定量具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，就像其他免疫測(cè)定法，RIA法需要先標(biāo)記的細(xì)胞因子特異性抗體和/或標(biāo)記的細(xì)胞因子或其受體與放射性同位素(主要是 I125) ，然后再進(jìn)行檢測(cè)。

o RIA的一個(gè)特殊優(yōu)勢(shì)是它對(duì)細(xì)胞因子的生物活性區(qū)域具有特異性，而不是對(duì)免疫活性區(qū)域的特異性，免疫活性區(qū)域可能很少或不參與細(xì)胞因子活性的表達(dá)。

o 但是，涉及使用放射性同位素的測(cè)定法大部分已被非放射性測(cè)定法所取代，因?yàn)榭紤]到輻射照射、勞動(dòng)密集耗時(shí)的程序和昂貴的設(shè)備要求。

·DNA微陣列

o DNA芯片或微陣列的廣泛應(yīng)用允許在mRNA水平上同時(shí)分析來自不同組織或細(xì)胞的數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)，該技術(shù)可用于確定表達(dá)細(xì)胞因子的基因在響應(yīng)外部信號(hào)、細(xì)胞應(yīng)激和各種病理?xiàng)l件時(shí)的上調(diào)。

o 微陣列是一種基于微雜交的檢測(cè)方法，通過構(gòu)建DNA微陣列，利用抗體-DNA與目標(biāo)蛋白質(zhì)的夾心免疫反應(yīng)，產(chǎn)生鄰位效應(yīng)促使DNA雜交，進(jìn)一步打開DNA微陣列上的捕獲發(fā)卡DNA并引發(fā)雜交鏈反應(yīng)，通過生物素-親和素反應(yīng)，使得大量辣根過氧化物酶(HRP)在DNA微陣列上結(jié)合，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的同時(shí)、高靈敏圖像檢測(cè)。

·抗體芯片

o 抗體芯片是一種可靠而穩(wěn)健的方法，用于從復(fù)雜蛋白質(zhì)組中提取多重?cái)?shù)據(jù)，具有高靈敏度、高特異性和高通量。第一個(gè)抗體芯片是由Chang于1983年開發(fā)的，在1cm2面積的玻璃蓋玻片上發(fā)現(xiàn)了10×10和20×20網(wǎng)格中的抗體。

o 當(dāng)前抗體芯片多用三明治夾心或直接標(biāo)記，使用化學(xué)發(fā)光或者熒光進(jìn)行檢測(cè)。三明治夾心抗體芯片使用抗體對(duì)，必須驗(yàn)證和檢查與陣列中所有其他抗原/抗體的交叉反應(yīng)性。

o 出于這個(gè)原因，芯片一般涵蓋10-80個(gè)分析指標(biāo)，通過組合多個(gè)陣列，可以檢測(cè)和定量人體樣品中多達(dá)1000種分泌的人類蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子、趨化因子、脂肪因子、生長(zhǎng)因子、蛋白酶、可溶性受體和其他蛋白質(zhì)。此外，小鼠、大鼠、牛、羊等不同種屬的芯片，也正在開發(fā)中。

·單分子技術(shù)

o單分子計(jì)數(shù)(Single Molecule Counting, SMC)技術(shù)最初由Singulex公司開發(fā)，將基于磁珠的免疫測(cè)定與單分子計(jì)數(shù)檢測(cè)相結(jié)合。

o 經(jīng)典的 96 孔板中，基于磁珠的免疫測(cè)定法用于形成夾心復(fù)合物(捕獲抗體-抗原-熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體包被的磁珠)。然后，破壞夾心復(fù)合物，并使用專有的數(shù)字SMC技術(shù)分析洗脫的熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體，使用激光共聚焦顯微鏡數(shù)字計(jì)數(shù)器對(duì)單分子熒光信號(hào)(“閃光")進(jìn)行計(jì)數(shù)。

o SMC 檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)人體樣品中的細(xì)胞因子，靈敏度為sub-pg/mL。

·免疫PCR技術(shù)

o 免疫PCR最初描述于1992年，結(jié)合免疫測(cè)定的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的高靈敏度。與傳統(tǒng)ELISA中底物和產(chǎn)物之間的線性關(guān)系相比，免疫PCR可實(shí)現(xiàn)信號(hào)指數(shù)級(jí)放大，靈敏度比普通ELISA高1000倍。

o 夾心形式的免疫PCR，與夾心ELISA相同，在捕獲抗體包被的96孔板中進(jìn)行。與 ELISA 測(cè)定中用于檢測(cè)的酶抗體偶聯(lián)物不同，免疫 PCR利用與 DNA 共價(jià)偶聯(lián)并通過定量 PCR 檢測(cè)的檢測(cè)抗體。

o 雖然免疫PCR的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的(例如，超靈敏、良好的重現(xiàn)性和普遍性)，但其主要局限性是背景高且需要大量的洗滌步驟。

·者鄰近連接技術(shù)

o 者鄰近連接測(cè)定(Proximity ligation assay, PLA)最初由Fredriksson等開發(fā)，使用對(duì)血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)具有親和力的DNA適配體來量化PGDF。

o 同源二聚體PDGF-BB可以容納兩個(gè)適配體分子，每個(gè)分子都具有引物結(jié)合的延伸和額外的延伸，在雜交到共同的連接器寡核苷酸時(shí)進(jìn)行連接。

o PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)可檢測(cè)到低至10-20 pmol濃度的細(xì)胞因子/蛋白。

·免疫磁減量檢測(cè)

o 2006年描述了磁減量生物分析技術(shù)，目前的免疫磁減量(Immunomagnetic reduction, IMR)測(cè)定，將捕獲抗體固定在磁性納米顆粒，這種納米顆粒均勻分散在溶液中，并通過施加外部多個(gè)磁場(chǎng)(即易受磁場(chǎng)影響)而振蕩。加入分析樣品后，由于抗體捕獲分析物分子，納米顆粒變得更重，導(dǎo)致納米粒子對(duì)磁場(chǎng)的響應(yīng)降低，降低程度對(duì)應(yīng)于樣品中存在的目標(biāo)分子的量，能夠檢測(cè)pg/mL濃度的細(xì)胞因子/蛋白。

o IMR測(cè)定的主要優(yōu)點(diǎn)是它是一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，不需要洗滌步驟即可去除未結(jié)合的試劑，具有高度的靈敏度和定量性。例如，淀粉樣蛋白-β1-42和α-突觸核蛋白的濃度范圍分別為1-50000 pg/mL和0.3 fg/mL-300 pg/mL。

o 與夾心免疫測(cè)定不同，IMR測(cè)定僅使用一種抗體(“捕獲"抗體)，測(cè)定特異性通過納米顆粒的振蕩運(yùn)動(dòng)來確保，其中微弱的非特異性抗原-抗體相互作用由于施加磁場(chǎng)在納米顆粒上引起的離心力而被破壞。

o IMR測(cè)定目前旨在識(shí)別疾病的早期階段，例如神經(jīng)退行性疾病、癌癥和病毒感染。

圖1. 免疫磁減量(IMR)檢測(cè)原理

1. 每個(gè)磁性納米粒，具有針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體的生物功能，在與ICP11結(jié)合之前，在施加的交流電(AC)磁場(chǎng)下振蕩。χac,0：磁性納米粒的原始多頻交流磁化率。(B)當(dāng)這些磁性納米粒與靶蛋白結(jié)合時(shí)，它們變得更大，有些甚至形成簇狀，這降低了試劑的交流磁化率。χac,φ：磁性納米粒與靶蛋白結(jié)合后的磁化率。

·微流體技術(shù)

o Usuba 等制造了一個(gè)具有微流體結(jié)構(gòu)的光子芯片(Photonic lab-on-a-chip, PhLoC)，用于快速檢測(cè) IL-2。

o PhLoC包括光學(xué)元件、測(cè)量室、空氣旁路和其他用于引入和沖洗溶液的流道，流道僅能夠?qū)⑷芤阂霚y(cè)量室并改善抗體在測(cè)量室表面上的固定，淋巴細(xì)胞分泌的 IL-2 可在 15 min內(nèi)測(cè)量，濃度范圍為 50-1000 pg/mL。

o 在芯片實(shí)驗(yàn)室設(shè)備中，微流控技術(shù)為實(shí)現(xiàn)更快速、更高效的體外檢測(cè)提供了有效的解決方案，因?yàn)?span style="font-weight: 600;">1)微流控通道具有較大的表面積與體積比，加速了抗原抗體反應(yīng)；2)微流控技術(shù)平臺(tái)最大限度地減少了昂貴試劑和珍貴樣品的消耗；3)可以通過將多個(gè)傳感器集成到通道中來實(shí)現(xiàn)多重分析。

圖2. 不同類型的微流控法檢測(cè)細(xì)胞因子原理圖

1. 具有集成光學(xué)和微流體組件的 PhLoC 示意圖；B) 測(cè)定初始階段單位細(xì)胞流體排列的 3D 圖形表示；C) 測(cè)定第二階段期間單元電池流體布置的 3D 圖形表示，詳細(xì)說明了 Proxim 手持式儀器的測(cè)定區(qū)域和電化學(xué)傳感器測(cè)試盒之間的流體端口和連接。

·質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)

o 質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)是將流式細(xì)胞術(shù)和元素質(zhì)譜技術(shù)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)相結(jié)合的一種新技術(shù)，已經(jīng)越來越多地用于快速分析單個(gè)細(xì)胞，這種分析使得能夠在單個(gè)細(xì)胞分辨率下測(cè)量超過40個(gè)細(xì)胞參數(shù)，顯著促進(jìn)了生物活性分子對(duì)細(xì)胞群體的高維、定量分析，從而增強(qiáng)了細(xì)胞學(xué)評(píng)估復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)和過程的能力。

o 質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)利用了稀土金屬同位素作為與抗體結(jié)合的標(biāo)記，而不是熒光物質(zhì)。由于具有離散讀數(shù)的特性，質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)中同位素作為報(bào)告物質(zhì)的使用增加了每個(gè)細(xì)胞可測(cè)量的參數(shù)數(shù)量。此外，該平臺(tái)具有數(shù)量上的準(zhǔn)確性，其靈敏度在四個(gè)數(shù)量級(jí)上是線性的。因此，高維質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)能夠以單細(xì)胞粒度同時(shí)、高靈敏度地測(cè)量來自先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞亞群的多種細(xì)胞因子。

o Baxter等開發(fā)了一種全面的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析方法，用于單次分析外周全血中的免疫表型和細(xì)胞因子產(chǎn)生，這種單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法使得能夠同時(shí)評(píng)估多種免疫細(xì)胞類型，并在患者特異性的“病原性"外周血液環(huán)境中檢測(cè)到各種細(xì)胞因子的變化。通過質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析外周血，還可以確定特定患者異常調(diào)節(jié)的細(xì)胞亞群及其異常的細(xì)胞因子產(chǎn)生，這使得治療方案的個(gè)性化成為可能。因此，可以在體外測(cè)試特定的治療選擇，以評(píng)估其免疫調(diào)節(jié)的有效性。

o 該技術(shù)也存在一些限制，包括對(duì)每個(gè)探針需求嚴(yán)格的金屬同位素(沒有前向或側(cè)向散射的等效物)以及破壞性(沒有排序細(xì)胞恢復(fù)的可能性)，當(dāng)前質(zhì)譜細(xì)胞儀的配置也具有有限的細(xì)胞透過率，因此需要更多的輸入細(xì)胞數(shù)量。

·基于熒光的細(xì)胞因子生物傳感器

o 熒光生物傳感器是一種基于與靶分子相互作用導(dǎo)致熒光特性發(fā)生變化的檢測(cè)方法，它廣泛用于分析傳感和光學(xué)成像。

o 當(dāng)靶分子被其受體識(shí)別時(shí)，熒光信號(hào)(如熒光強(qiáng)度、發(fā)射波長(zhǎng)和熒光壽命)可以通過不同機(jī)制(電子轉(zhuǎn)移(eT)、電荷轉(zhuǎn)移(CT)或能量轉(zhuǎn)移(ET)過程)以猝滅、增強(qiáng)或熒光最大值移位的形式被觀察到。

o 由于其高靈敏度、快速響應(yīng)時(shí)間、技術(shù)簡(jiǎn)易性、多種染料選擇用于多重檢測(cè)以及能夠以廉價(jià)的方式實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)，熒光免疫分析已成為定性和定量檢測(cè)細(xì)胞因子的廣泛應(yīng)用方法之一。

o Rahimian等報(bào)道了一種微囊化熒光免疫分析，用于檢測(cè)經(jīng)最少處理的血液中的IFN- 和TNF- ，檢測(cè)限為分別為14.8×10-12M和14.4×10-12 M。白細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子擴(kuò)散到微囊的核心，并被核心中的修飾抗體的珠子捕獲，目標(biāo)分子通過與二級(jí)熒光標(biāo)記抗體染色來檢測(cè)。封裝的微珠的熒光強(qiáng)度與其在血液中的濃度相關(guān)，這種封裝的免疫分析代表了在血液等高度復(fù)雜環(huán)境中保持感測(cè)元件操作的一種有前途的策略。

o 為了通過在細(xì)胞膜上應(yīng)用捕獲技術(shù)來檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，提出了細(xì)胞表面ELISA(OnELISA)的配置。這已經(jīng)用于鑒定和篩選高細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，利用商業(yè)可獲得的標(biāo)記有dragon green 熒光的磁珠，OnELISA是一種夾心免疫傳感器，能夠在單細(xì)胞水平(0.1 pg/mL)檢測(cè)IL-6。這些細(xì)胞表面生物傳感器為識(shí)別和篩選高細(xì)胞因子分泌提供了有前途的方法，用于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

o 在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方面，熒光生物傳感器已被應(yīng)用。例如，一種基于石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)的簡(jiǎn)單而敏感的“開關(guān)式"納米傳感器已經(jīng)被開發(fā)用于檢測(cè)IFN- 的細(xì)胞內(nèi)存在，具有2 pg/mL的靈敏度。聚集GQDs的自熄滅會(huì)關(guān)閉熒光，而由于靶分子IFN- 的存在引起的GQDs的解聚會(huì)導(dǎo)致與IFN- 濃度成正比的熒光恢復(fù)。這些熒光納米傳感器已成功用于活PBMC和BV2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)IFN- 的檢測(cè)作為基本模型，并且可以作為針對(duì)一系列細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的通用開啟傳感探針。

o 利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光劑的性質(zhì)，報(bào)道了一種用于測(cè)量由活細(xì)胞分泌的細(xì)胞內(nèi)IFN- 的熒光適配體傳感器，其在體外條件下的低檢測(cè)限為2 pg/mL。這種適配體傳感器由顯示強(qiáng)紅色發(fā)射的熒光素(TPEN3)和具有高親和力的IFN- 的寡核苷酸組成，探針能夠在低濃度下定位細(xì)胞內(nèi)IFN- ，并且成功用于實(shí)時(shí)成像，表現(xiàn)出優(yōu)良的細(xì)胞透過性和生物相容性以及低毒性。

o 熒光基生物傳感器具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、非破壞性和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。然而，使用基于熒光的光學(xué)生物傳感器的主要缺點(diǎn)是背景干擾和樣品標(biāo)記需要熒光試劑，這增加了操作的時(shí)間和成本。

圖3. 基于熒光的細(xì)胞因子生物傳感器

1. 微膠囊感測(cè)的示意圖；B)磁性熒光納米顆粒被細(xì)胞生物素化表面上的抗體捕獲的試驗(yàn)；C)用于在單細(xì)胞水平上測(cè)量細(xì)胞因子分泌的T細(xì)胞表面寡核苷酸傳感器的示意圖；D)利用由CHA激活的三種靶標(biāo)響應(yīng)性脂質(zhì)體的熒光法檢測(cè)IFN- 的示意圖。

·基于SPR的細(xì)胞因子生物傳感器

o 表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)廣泛應(yīng)用于臨床分析中，因其提供了一種無標(biāo)記且實(shí)時(shí)的方式來測(cè)量生物分子間的相互作用。

o 在SPR系統(tǒng)中，分析物被生物分子識(shí)別元素捕獲在SPR生物傳感器的金屬表面上，改變了金屬表面的折射率，折射率的變化可以通過不同的光學(xué)手段(如強(qiáng)度調(diào)制、角度調(diào)制、波長(zhǎng)調(diào)制、相位調(diào)制，甚至偏振調(diào)制)進(jìn)行精確測(cè)量。

o 作為一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，可以通過測(cè)量共振谷的光譜偏移來連續(xù)監(jiān)測(cè)分析物的濃度，而無需額外的標(biāo)記。由于其高靈敏度和能夠?qū)崟r(shí)進(jìn)行無標(biāo)記測(cè)量，基于SPR的生物傳感器已成功應(yīng)用于疾病診斷中的細(xì)胞因子測(cè)量。

o Wu等報(bào)道了一種用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人CD4+ T細(xì)胞捕獲和它們動(dòng)態(tài)產(chǎn)生IFN- 的無標(biāo)記SPR生物傳感器，從而能夠以高靈敏度(85.5%)和特異性(97.7%)診斷結(jié)核病(TB)的臨床樣本。CD4 + T細(xì)胞被抗CD4抗體捕獲，含有TB特異蛋白的培養(yǎng)基被注入以刺激捕獲的CD4 + T細(xì)胞釋放IFN- 。當(dāng)添加TB特異蛋白時(shí)，SPR信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，允許對(duì)CD4 +細(xì)胞分泌的IFN- 蛋白進(jìn)行定量。

o Liu等制備了一種局部表面等離子共振(LSPR)免疫分析用于檢測(cè)刺激的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IL-6和TNF- )，利用電子束光刻和海藻糖聚合物直接在硅襯底上載入抗體。這種夾心免疫分析可通過暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行可視化，利用銀增強(qiáng)金納米粒子次級(jí)抗體的表面等離子共振，成功地展示了在單個(gè)芯片上對(duì)IL-6和TNF- 的多重測(cè)量，具有很高的特異性和靈敏度(TNF- 為5 pg/mL，IL-6為50 pg/mL)，這種直接制備用于細(xì)胞因子檢測(cè)的捕獲抗體圖案的方法對(duì)于生物傳感應(yīng)用具有潛在價(jià)值。

o Chen等開發(fā)了一種無標(biāo)記、多陣列局部表面等離子共振(LSPR)光學(xué)生物傳感器芯片，用于大規(guī)模并行高通量檢測(cè)多種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN- 、TNF- )。該器件采用易于實(shí)現(xiàn)的一步微流體圖案化和金納米棒(AuNRs)的抗體偶聯(lián)來制備，納米棒微陣列制備是通過一步微流體圖案化技術(shù)完成的，該技術(shù)利用了納米棒與基底表面之間的靜電吸引相互作用。隨后，這些納米棒微陣列被集成在一個(gè)具有8個(gè)并行微流體檢測(cè)通道的微流體芯片中，包括用于試劑加載和清洗的入口和出口端口。特定抗體通過硫化交聯(lián)劑和EDC/NHC化學(xué)反應(yīng)與圖案化的AuNR微陣列結(jié)合。目前的芯片設(shè)計(jì)集成了480個(gè)AuNR微陣列傳感器點(diǎn)，制備的LSPR微陣列芯片然后在暗場(chǎng)顯微鏡和掃描電子顯微鏡(SEM)下成像，這種LSPR生物傳感技術(shù)允許從1μL血清樣品中對(duì)濃度為5-20 pg/mL的細(xì)胞因子進(jìn)行高靈敏度的定量測(cè)量。

o Zhu等報(bào)道了細(xì)胞捕獲和基于LSPR技術(shù)的金帽納米柱結(jié)構(gòu)環(huán)氧乙烯共聚物(COP)薄膜的簡(jiǎn)單協(xié)同集成，用于IL-6的檢測(cè)，靈敏度為190.2 nm/RIU，檢測(cè)限為10 ng/mL。在這項(xiàng)研究中，新鮮培養(yǎng)的IL-6過表達(dá)Jurkat細(xì)胞被用于評(píng)估這種基于LSPR的生物傳感器的靈敏度和能力，培養(yǎng)的細(xì)胞直接被厚的COP細(xì)胞捕獲芯片捕獲，并開始釋放IL-6，IL-6將立即與納米柱狀LSPR檢測(cè)薄膜表面的抗體結(jié)合而無需刺激。制備的裝置顯示了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子的潛力，這將允許我們識(shí)別受測(cè)單個(gè)細(xì)胞的生存能力和生物變異。

o 雖然SPR在蛋白質(zhì)檢測(cè)方面有著廣泛的應(yīng)用，但SPR傳感器普遍面臨的一個(gè)常見挑戰(zhàn)是傳感器上產(chǎn)生的非特異性結(jié)合事件產(chǎn)生的信號(hào)問題，這是一個(gè)需要通過應(yīng)用防污策略進(jìn)行更多研究的問題。

圖4. 基于表面等離子共振的細(xì)胞因子生物傳感器

1. CD4+ T細(xì)胞捕獲和IFN-γ釋放的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的示意圖。B)用于多重細(xì)胞因子檢測(cè)的直接蛋白圖案的示意圖C)LSPR微陣列芯片的示意圖D)集成的局部表面等離子共振(LSPR)細(xì)胞因子檢測(cè)的示意圖。

·基于SERS的細(xì)胞因子傳感器

o 表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Spectroscopy, SERS)已成為一種強(qiáng)大的振動(dòng)光譜技術(shù)，通過放大由局部表面等離子體激發(fā)產(chǎn)生的電磁場(chǎng)，可以對(duì)低濃度分析物進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。

o 基于SERS的生物傳感器作為一種流行且有前景的方法，由于其高靈敏度、高特異性和多通道非破壞性檢測(cè)能力等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于細(xì)胞因子的快速和定量測(cè)量。

o Lai等利用磁珠pull-down法結(jié)合SERS進(jìn)行了TNF- 的快速敏感檢測(cè)，穩(wěn)定、單分散且高靈敏的SERS標(biāo)記由純化的包埋在二氧化硅中的小金納米顆粒團(tuán)聚體制備而成，二氧化硅的包埋提高了SERS標(biāo)記的穩(wěn)定性，使信號(hào)重復(fù)性好，并為后續(xù)的生物偶聯(lián)提供了堅(jiān)固的表面，具有高特異性、選擇性和對(duì)TNF- 濃度的靈敏度可達(dá)1 pg/mL。通過識(shí)別膠體混合物中多達(dá)三種不同拉曼報(bào)告物的特征拉曼峰和條形碼信號(hào)，顯示了這些SERS標(biāo)記作為靈敏報(bào)告物在多通道生物分析應(yīng)用中的巨大潛力。

o Kaminska等開發(fā)了一種基于硅藻生物硅質(zhì)為免疫基質(zhì)、以DTNB(即5,5'-二硫代二硝基苯酸)為拉曼報(bào)告物的SERS免疫分析方法，用于血漿中IL-8的檢測(cè)。這些帶有DTNB標(biāo)記的免疫性金納米顆?？梢耘c生物硅質(zhì)材料上固定的IL-8抗原和抗體形成夾心結(jié)構(gòu)，建立的SERS免疫分析法具有較低的檢測(cè)限(6.2 pg/mL)，為臨床環(huán)境中細(xì)胞因子的超靈敏和高特異性檢測(cè)提供了寶貴的平臺(tái)。

o 為了對(duì)多種細(xì)胞因子進(jìn)行敏感和同時(shí)檢測(cè)，Li等開發(fā)了由金核、拉曼報(bào)告細(xì)胞和銀殼組成的SERS納米標(biāo)記，用于敏感和多通道識(shí)別從淋巴瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IFN- 、TNF- 和IL-10)，該SERS免疫分析法顯示出較高的靈敏度(4.5 pg/mL)和良好的特異性。更重要的是，與許多傳統(tǒng)方法相比，這種夾心免疫分析策略的響應(yīng)速度更快，因?yàn)樗哂卸嗤ǖ拦δ?，而其檢測(cè)限和準(zhǔn)確性與標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法相當(dāng)。

o 在另一項(xiàng)與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)相關(guān)的疾病診斷工作中，報(bào)道了一種基于紙張的SERS分析法，用于敏感的雙重細(xì)胞因子(IL-10和MCP-1)檢測(cè)，該SERS生物傳感器結(jié)合了一種利用聚丙烯(PP)基底和聚四氟乙烯(PTFE)涂層制成的聚合物膜的納米多孔網(wǎng)絡(luò)膜作為基底，以及SERS納米標(biāo)記作為信號(hào)檢測(cè)探針以及夾心設(shè)計(jì)，它表現(xiàn)出對(duì)人血清中細(xì)胞因子目標(biāo)的靈敏和特異性識(shí)別和定量測(cè)量的優(yōu)秀感測(cè)特性。在這項(xiàng)工作中，增加的表面積提供了高載量的捕獲抗體，從而增強(qiáng)了靈敏度。由于夾心設(shè)計(jì)中的兩層金納米顆粒的特點(diǎn)，產(chǎn)生了金納米顆粒之間的小間隙；這產(chǎn)生了“熱點(diǎn)"效應(yīng)，可以增強(qiáng)SERS信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了低檢測(cè)限(0.1 pg/mL)的高靈敏度檢測(cè)。因此，基于紙張的SERS分析平臺(tái)可以潛在地用于細(xì)胞因子的檢測(cè)，甚至作為商業(yè)單位，并且在復(fù)雜環(huán)境中進(jìn)行多通道目標(biāo)分析具有巨大潛力。

圖5. 基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的細(xì)胞因子傳感器

1. 用于檢測(cè)淋巴瘤分泌的細(xì)胞因子的多重SERS納米標(biāo)記的示意圖；B)用于檢測(cè)淋巴瘤分泌的細(xì)胞因子的多重SERS納米標(biāo)記；C)用于檢測(cè)淋巴瘤分泌的細(xì)胞因子的多重SERS納米標(biāo)記；D)基于紙基底的 MCP-1 和 IL-10 雙重檢測(cè)的檢測(cè)方法工作流程圖。

·基于電化學(xué)的細(xì)胞因子生物傳感器

o 電化學(xué)轉(zhuǎn)換作為一種生物傳感技術(shù)非常受歡迎，與其他方法相比，電化學(xué)技術(shù)具有自身的優(yōu)勢(shì)，如低成本，在安培計(jì)量中特別具有高靈敏度，并且便于設(shè)備微型化。電信號(hào)的輸出可以是阻抗、電流和電壓，許多電化學(xué)生物傳感器已經(jīng)被開發(fā)用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。

o Filik等總結(jié)了近期針對(duì)TNF- 測(cè)定的多種電化學(xué)測(cè)定法的發(fā)展，展示了各種新穎的感應(yīng)策略，用于改進(jìn)免疫電化學(xué)傳感器以選擇性地檢測(cè)細(xì)胞因子。Sanchez-Tirado等報(bào)道了一種簡(jiǎn)單而靈敏的安培計(jì)量免疫傳感測(cè)定法，利用植入電化學(xué)支架的出色性能，用于唾液中IFN- 的共價(jià)固定生物分子的檢測(cè)。圖6A顯示了這種電化學(xué)免疫傳感器的制備步驟以及安培計(jì)量檢測(cè)中涉及的反應(yīng)。屏印碳電極(SPCE)通過循環(huán)伏安法將對(duì)氨基苯甲酸偶氮鹽接枝到電極表面(步驟1)以共價(jià)固定捕獲抗體(步驟2)，剩余的自由活性位點(diǎn)用BSA阻斷(步驟3)。在捕獲IFN- 后，使用生物素-抗IFN和過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行夾心型免疫分析(步驟4)。通過在氫醌(HQ)存在下向電極表面添加過氧化氫溶液(步驟5)進(jìn)行安培計(jì)量測(cè)定，獲得了1.6 pg/mL的低檢測(cè)限，用于IFN- 的定量。這種電化學(xué)免疫傳感器所展示的分析性能，包括可丟棄性和使用袖珍式電化學(xué)儀器的可能性，使其具有吸引力，用于開發(fā)用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量唾液中IFN- 的POC系統(tǒng)。另一項(xiàng)發(fā)展是基于氧化石墨烯(GO)薄膜修飾的電化學(xué)納米夾心裝置，用于IL-6的檢測(cè)。

o 為了通過電化學(xué)測(cè)定實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞因子的測(cè)量，Shen等制造了無標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器，用于帕金森病小鼠模型中多種細(xì)胞因子的體內(nèi)檢測(cè)。Wei等還開發(fā)了一種電化學(xué)免疫傳感器，用于同時(shí)檢測(cè)三種細(xì)胞因子IL-6、IL-1 和TNF- 。玻璃碳(GC)表面被功能化，將4-羧基苯和4-氨基苯磷酸膽堿(PPC)的混合層附著為感測(cè)界面，用于固定IL-6、IL-1 和TNF- 的捕獲單克隆抗體。捕獲IL-6、IL-1 和TNF- 后，引入載有氧化還原探針(尼羅藍(lán)(NB)、亞甲基藍(lán)(MB)或二茂鐵(Fc))和特定細(xì)胞因子的抗體的GO。通過監(jiān)測(cè)信號(hào)報(bào)告物的電化學(xué)信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子的定量檢測(cè)。該系統(tǒng)成功地用于同時(shí)檢測(cè)，表現(xiàn)出良好的靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性和恢復(fù)性能。Sanchez-Tirado等人開發(fā)了一種雙壁碳納米管功能化的雙SPCE，用于血清和唾液中IL-1 和TNF- 的同時(shí)檢測(cè)。圖6B顯示了雙電化學(xué)免疫傳感器的制備方案。在每個(gè)雙SPCE表面滴加Mix&GO后，固定了IL-1 和TNF- 的抗體，然后通過BSA阻斷電極表面上剩余的活性自由位點(diǎn)。然后，通過將目標(biāo)細(xì)胞因子和生物素化的檢測(cè)抗體組合來實(shí)現(xiàn)夾心型分析。進(jìn)一步通過聚-HRP-Strept共軛實(shí)現(xiàn)過氧化氫作為HRP底物和HQ作為氧化還原介質(zhì)的IL-1 和TNF- 的安培計(jì)量確定。

o 對(duì)于免疫傳感器，基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的適配體的電化學(xué)生物傳感器也可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)細(xì)胞因子的檢測(cè)。特別是，為了提高基于適配體的細(xì)胞因子生物傳感的靈敏度和穩(wěn)健性，表面納米制造和比率測(cè)量是重要的。Liu等開發(fā)了一種基于外切酶介導(dǎo)的表面啟動(dòng)酶聚合(SIEP)結(jié)合[Ru(NH3)6]3+用于IFN- 檢測(cè)的適配體基電化學(xué)免疫傳感器。首先，電極表面被金納米顆粒-石墨烯納米復(fù)合材料(Au-Gra)功能化。然后，在修飾的電極表面上固定了雜交的雙鏈DNA(dsDNA)，然后通過己烷硫醇溶液(HT)阻斷了非特異性位點(diǎn)。添加IFN- 后，適配體從dsDNA中被釋放出來，并被RecJf外切酶選擇性地消化，使IFN- 釋放用于目標(biāo)回收。然后，在循環(huán)過程中形成了大量的單鏈捕獲探針。隨后，在電極表面的單鏈捕獲探針上捕獲了大量的信號(hào)探針標(biāo)記的Au@Fe3O4(SP-Au@Fe3O4)。最后，通過端尾脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)延伸，形成了長(zhǎng)鏈ssDNA結(jié)構(gòu)，以[Ru(NH3)6]3+的靜電吸附來產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。該提議的適配體傳感器顯示了0.003 ng/mL的低檢測(cè)限，為IFN- 和其他細(xì)胞因子的可靠檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單、靈敏和強(qiáng)大的工具。此外，該傳感器具有臨床診斷、傳染病監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試的潛力。

o Ni等開發(fā)了一種穩(wěn)健的適配體傳感器，通過修飾亞甲基藍(lán)負(fù)載的石墨烯氧化物(GO/MB)和鐵素標(biāo)記的適配體到GC電極上，實(shí)現(xiàn)了在血清中VEGF的雙電化學(xué)信號(hào)模式比率定量測(cè)定，具有更寬的線性范圍(10-5×102pg/mL)和更好的靈敏度(10 pg/mL)。

o Liu等展示了基于大型納米結(jié)構(gòu)表面的適配體基電化學(xué)生物傳感器對(duì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的更敏感分析，通過改進(jìn)的運(yùn)輸和增強(qiáng)的單位面積表面積。利用覆蓋有金的硅納米線(Si NWs)作為工作電極，實(shí)現(xiàn)了IFN- 的適配體基檢測(cè)，適配體分子被設(shè)計(jì)成形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而氧化還原報(bào)告物質(zhì)甲基藍(lán)與電極表面距離較近，IFN- 的結(jié)合導(dǎo)致氧化還原標(biāo)簽離電極進(jìn)一步移動(dòng)，改變了發(fā)夾的構(gòu)象，并抑制了來自氧化還原報(bào)告物質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移，降低了電化學(xué)氧化還原信號(hào)。使用方波伏安法量化了IFN- 結(jié)合前后的法拉第電流的差異。

o 圖6D顯示了懸浮細(xì)胞和平面Au電極以及AuNWs電極上的細(xì)胞沉積和細(xì)胞因子IFN- 分泌的不同行為。一系列實(shí)驗(yàn)表明，與標(biāo)準(zhǔn)平面電極相比，NW適配體傳感器對(duì)IFN- 的響應(yīng)更快、更敏感，允許使用低檢測(cè)限(0.14 ng/mL)測(cè)量IFN- 。該NW適配體傳感器具有更大的表面積和更高的適配體包裝密度，并且受到直接白細(xì)胞沉積的影響較小。它在細(xì)胞因子檢測(cè)方面具有巨大潛力，并滿足了對(duì)疾病敏感診斷的重要需求。

圖6. 基于電化學(xué)的細(xì)胞因子生物傳感器

1. 用于測(cè)定IFN- 的電化學(xué)免疫傳感器制備步驟的示意圖；B)用于多重確定IL-1 和TNF- 的雙重電化學(xué)免疫傳感器制備步驟的示意圖；C)基于外切酶催化的靶分子回收和表面啟動(dòng)酶聚合的逐步Aptasensor制備示意圖；D)基于Aptamer的IFN- 電化學(xué)傳感器。

·其他類型的細(xì)胞因子生物傳感器

o CRISPR/Cas(聚集的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白)生物傳感是一種高靈敏度和選擇性的工具，可用于檢測(cè)不同的目標(biāo)，包括細(xì)胞因子。除了Cas9和Cas12因子外，最近發(fā)現(xiàn)的Cas13a效應(yīng)子的背景RNA裂解活性引起了更大的關(guān)注，以開發(fā)用于核酸檢測(cè)的新型生物傳感技術(shù)。CRISPR/Cas13a還使得開發(fā)具有高靈敏度的直接RNA測(cè)定方法成為可能，用于細(xì)胞因子檢測(cè)。

o Chen等報(bào)告了一種CRISPR/Cas13a信號(hào)放大聯(lián)合免疫吸附測(cè)定法(CLISA)，用于IL-6和VEGF的檢測(cè)，該測(cè)定法通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄和CRISPR/Cas13a的背景裂解活性使輸出信號(hào)進(jìn)行了雙重放大，T7聚合酶可以識(shí)別啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并產(chǎn)生許多單鏈RNA分子。CRISPR/Cas13a系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確識(shí)別轉(zhuǎn)錄的RNA分子，導(dǎo)致激活CRISPR/Cas13的跨切活性，系統(tǒng)中帶有熒光團(tuán)和猝滅劑團(tuán)的短單鏈RNA報(bào)告物可以通過跨切活性被切割，生成熒光信號(hào)。這種CRISPR/Cas13a生物傳感具有很高的靈敏度，并且對(duì)細(xì)胞因子測(cè)量的檢測(cè)限可達(dá)到飛秒摩爾水平，可以快速同時(shí)對(duì)大量樣本進(jìn)行篩選，為生物傳感、醫(yī)學(xué)研究和分子診斷提供了潛在的超靈敏檢測(cè)方法。

o 基于顏色變化的比色傳感器因其固有的優(yōu)勢(shì)(如簡(jiǎn)單處理和視覺指示)而引起關(guān)注，可用于各種分析物的即時(shí)檢測(cè)。貴金屬納米顆粒的光學(xué)性質(zhì)在其與分析物相互作用時(shí)會(huì)引起可見顏色變化，這是因?yàn)榧{米顆粒的分散和聚集。因此，貴金屬納米顆粒在比色傳感中具有生物分子檢測(cè)的潛力。金納米顆粒(AuNPs)是用于細(xì)胞因子檢測(cè)的比色分析中的貴金屬實(shí)體之一。例如，Zhang等報(bào)道了一種基于寡核苷酸的比色生物傳感器，利用AuNPs結(jié)合支鏈DNA擴(kuò)增策略來定量VEGF，這是血管生成和血管通透性的重要細(xì)胞因子。使用這種比色生物傳感器，可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到3.7飛摩爾的VEGF。Wu等提出了一種基于目標(biāo)觸發(fā)的Aptazyme與AuNPs結(jié)合的VEGF測(cè)量的比色傳感器。如圖7B所示，這種測(cè)定法設(shè)計(jì)了一個(gè)包含VEGF適配體(黑色)、DNA酶(紫色)和短干擾序列(黃色)的Aptazyme。此外，設(shè)計(jì)了一個(gè)鏈接物，其中包含AuNPs的交聯(lián)序列和DNA酶的底物序列。在存在VEGF的情況下，VEGF與其適配體之間的識(shí)別引起Aptazyme的構(gòu)象變化，從而激活DNA酶。由于AuNPs無法交聯(lián)，AuNPs溶液的顏色保持為紅色，在目標(biāo)蛋白質(zhì)缺失時(shí)，顏色會(huì)發(fā)生變化?；陬伾淖兓?，開發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)有效的方法，用于VEGF的定量測(cè)定，檢測(cè)限低至0.1×10-9M。

o 基于微環(huán)共振器(MR)的傳感，基于準(zhǔn)確測(cè)量接收層折射率的變化，用于目標(biāo)和抗體修飾的微環(huán)之間的表面結(jié)合的實(shí)時(shí)檢測(cè)，已經(jīng)在標(biāo)簽自由和實(shí)時(shí)生物分子檢測(cè)中找到了許多應(yīng)用。這種基于MR的傳感器的優(yōu)點(diǎn)包括高機(jī)械穩(wěn)定性、檢測(cè)靈敏度、可擴(kuò)展到傳感器網(wǎng)絡(luò)的可擴(kuò)展性以及由于硅片尺寸加工而降低的成本。因此，這種方法代表了一種有前途的平臺(tái)，用于細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)檢測(cè)。硅光子微環(huán)諧振器，一類高Q光學(xué)微腔，由于實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)能力、小尺寸上的高可擴(kuò)展性、每個(gè)器件低成本和易于制造，最近顯示出在細(xì)胞因子的無標(biāo)簽生物分析中具有潛力。例如，Kindt等報(bào)道了一個(gè)集成了酶信號(hào)增強(qiáng)方案的多重可擴(kuò)展硅光子MR平臺(tái)，用于在未稀釋的腦脊液中同時(shí)定量IL-2、IL-6和IL-8，提供了1 pg/m或以下的檢測(cè)限，基于MR的傳感平臺(tái)在超低濃度下對(duì)多種細(xì)胞因子的多重檢測(cè)具有重要潛力。此外，硅光子MR平臺(tái)結(jié)合夾心免疫測(cè)定法可以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，Luchansky和Bailey利用一個(gè)固有可擴(kuò)展的硅光子MR分析平臺(tái)，在僅5min的測(cè)定中實(shí)現(xiàn)了來自原代人類T細(xì)胞群體分泌的四種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和TNF- )的同時(shí)檢測(cè)?？傊贛R的生物傳感器是一種有前景的平臺(tái)，可用于多種多重和實(shí)時(shí)體外診斷應(yīng)用，并應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行研究。

o 干涉反射成像傳感器(IRIS)是另一種用于細(xì)胞因子的無標(biāo)記和實(shí)時(shí)檢測(cè)的潛在技術(shù)，在這種生物傳感過程中，傳導(dǎo)基于光譜反射率。隨著上層的整體厚度增加，由于生物質(zhì)在分層基板表面的積累，上層表面與覆蓋有二氧化硅(Si-SiO2)界面層的硅基板之間的光學(xué)路徑差(OPD)也增加，導(dǎo)致光譜反射率發(fā)生可量化的變化。因此，這種功能性平臺(tái)允許對(duì)表面結(jié)合的生物分子進(jìn)行準(zhǔn)確、無標(biāo)記和動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)。IRIS技術(shù)的實(shí)用性已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6的實(shí)時(shí)測(cè)量中得到了證明，無標(biāo)記的生物傳感器使得對(duì)IL-6的檢測(cè)信號(hào)提高了7倍以上，其檢測(cè)限接近2 ng/mL。因此，IRIS可用作體外免疫反應(yīng)的分析平臺(tái)或用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。

圖7. 其他類型的細(xì)胞因子生物傳感器

1. CRISPR/Cas13a信號(hào)放大系統(tǒng)的示意圖；B) 利用VEGF作為示例的蛋白質(zhì)檢測(cè)的提出方法。

[細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)的比較]

• ·正如我們?cè)谇懊娴恼鹿?jié)中所討論的，對(duì)臨床相關(guān)樣本中多種細(xì)胞因子進(jìn)行定量分析在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中至關(guān)重要。ELISA可用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞因子，而許多商業(yè)化的多重技術(shù)(基于Luminex或流式細(xì)胞術(shù)(FCM))也可用于檢測(cè)。大多數(shù)基于熒光珠技術(shù)的商業(yè)多重檢測(cè)試劑盒允許在小體積中對(duì)多種細(xì)胞因子進(jìn)行分析，這些商業(yè)化的多重檢測(cè)試劑盒比單重檢測(cè)試劑盒(例如ELISA)具有更多優(yōu)勢(shì)，包括：1)對(duì)樣本體積要求較小，2)減少檢測(cè)時(shí)間，3)對(duì)每個(gè)分析物的量化范圍更廣。

4種細(xì)胞因子檢測(cè)方法比較

A 

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