【概述】

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)，又叫烏拉坦（Urethane），是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病。人類從膳食中攝入的氨基甲酸乙酯，主要來自發(fā)酵食物和飲品，其中酒*品是已知的氨基甲酸乙酯主要來源。

調(diào)查顯示，如果飲用氨基甲酸乙酯含量超過30×10-6g/kg的酒，人飲用后患癌的機(jī)率大大增加。根據(jù)加利福尼亞環(huán)保機(jī)構(gòu)的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得知，假設(shè)每個(gè)人的患癌癥的機(jī)率為1×10-5，推斷氨基甲酸乙酯的攝入量大約為0.7μg/d。因此黃酒中氨基甲酸乙酯是危害人類健康的一個(gè)不可忽視的因素。上已就不同酒*品的氨基甲酸乙酯含量進(jìn)行了廣泛研究，一些國家已制定出酒*品的氨基甲酸乙酯高*，如加拿大是多種酒*品制訂氨基甲酸乙酯高*的國家，由30μg/L (葡萄酒)至400μg/L(水果白蘭地)不等。美國、日本、韓國等亦相繼制訂出部分酒的氨基甲酸乙酯高限值。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

1.色譜柱：TG-WAXMS  30 m×0.25 mm×0.25μm石英毛細(xì)管柱；

2.進(jìn)樣口溫度：220℃；

3.升溫程序：初始溫度為50℃，保持1min，以8℃/min

升至180℃，保持10min；

4.載氣：氦氣（純度≥99.999%）；

5.載氣流速：1.0mL/min；

6.進(jìn)樣量：13μL；

7.進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

8.離子源：EI源；

9.離子源溫度：250℃；

10.傳輸線溫度：280℃；

11.采集模式：SIM模式(44,62,74,89,64,76)。

【樣品提取】

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1）稱取0.0161g（至0.0001g）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.5%），用甲醇溶劑、定容至10mL，此時(shí)

溶液濃度為1585.85μg/mL；

2）稱取0.0334g（至0.0001g）D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.7%），用甲醇溶劑、定容至10mL，此時(shí)溶液濃度為3296.58μg/mL；

3）100μg/mL氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取63μL（1）溶液，加937μL甲醇，定容至1mL，混勻。

4）100μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取30μL（2）溶液，加970μL甲醇，定容至1mL，混勻。

5）2μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取20μL（4）溶液，加980μL甲醇，定容至1mL，混勻。

6）10μg/mL氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取100μL（3）溶液，加900μL甲醇，定容至1mL，混勻。

7）0.5μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取50μL（6）溶液，加950μL甲醇，定容至1mL，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的制備

分別準(zhǔn)確吸取氨基甲酸乙酯中間液（0.5μg/mL）20、50、100、200、400μL和氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)中間（10.0μg/mL）40、100μL于進(jìn)樣小瓶中，各加2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液100μL，用甲醇定容至1mL，得到10.0、25.0、50.0、100、200、400、1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，供GC-MS分析。

樣品制備

取100μL樣品（95%乙醇），加入2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液100μL，用甲醇定容至1mL搖勻待測。

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

本文按照GB 5009.223-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測定》，建立了ISQ-LT GC-MS結(jié)合CSR大體積進(jìn)樣技術(shù)測定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，考察了方法檢出限、校準(zhǔn)曲線及線性范圍、響應(yīng)值日內(nèi)日間重復(fù)性、保留時(shí)間日內(nèi)日間重復(fù)性、系統(tǒng)抗污染能力等，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

1采用CSR大體積進(jìn)樣技術(shù)測定白酒中氨基甲酸乙酯

1.1 CSR大體積進(jìn)樣原理介紹

溶劑濃縮大體積進(jìn)樣技術(shù)（Concurrent Solvent Recondensation,簡稱CSR），即在進(jìn)樣口和分析柱間連接一段空的預(yù)柱，且襯管中裝填玻璃棉，采用傳統(tǒng)的分流不分流進(jìn)樣口，進(jìn)樣口處于恒定的較高溫度，自動(dòng)進(jìn)樣器插入汽化室5 mm，保持針頭部分溫度較低，快速注入樣品。樣品以帶狀液體的狀態(tài)離開注射器，被收集在襯管底部的少量玻璃棉上，開始緩慢汽化。由于襯管是一個(gè)密閉體系，蒸汽體積迅速膨脹，取代和壓縮載氣，使得襯管內(nèi)壓力迅速增大，而載氣阻止了溶劑蒸汽從汽化室溢出，從而產(chǎn)生了“壓力涌浪”效應(yīng)，迫使溶劑蒸汽轉(zhuǎn)移到低溫的預(yù)柱上。溶劑蒸汽在柱頭上冷凝形成液膜，進(jìn)一步加速了蒸汽的轉(zhuǎn)移，此時(shí)溶劑汽化和冷凝同時(shí)發(fā)生，使得進(jìn)樣體積不再受汽化體積的限制，從而實(shí)現(xiàn)大體積進(jìn)樣，預(yù)柱起承載樣品的作用。圖1為CSR基本原理圖解，圖2為CSR進(jìn)樣過程。

圖1. CSR基本原理圖解

圖2. CSR進(jìn)樣過程

1.2 CSR大體積進(jìn)樣技術(shù)特點(diǎn)

PTV進(jìn)樣雖然進(jìn)樣體積可高達(dá)250μL，但是在溶劑蒸發(fā)的過程中會(huì)造成低沸點(diǎn)化合物的損失；而OCI進(jìn)樣雖然不會(huì)造成低沸點(diǎn)化合物損失，但由于樣品溶液直接注入到色譜柱中，很容易造成色譜柱的污染，導(dǎo)致某些化合物響應(yīng)偏低、且影響分離。相比，CSR技術(shù)更具有*性，具備以下三個(gè)特點(diǎn)。

（1）特點(diǎn)一：顯著提高檢測靈敏度

CSR大進(jìn)樣體積為50μL，能顯著提高檢測靈敏度。例如：CSR大體積進(jìn)樣氣相色譜質(zhì)譜中的應(yīng)用，如圖3所示，進(jìn)樣量為1、2、3、4、5μL時(shí)所得的結(jié)果比較，從圖中可以得出，隨著進(jìn)樣體積的增加，響應(yīng)值幾乎呈線性倍數(shù)增加，充分表明增加進(jìn)樣量可以顯著提高檢測靈敏度。

圖3.不同進(jìn)樣體積結(jié)果

（2）特點(diǎn)二：分析高、低沸點(diǎn)化合物無歧視

如圖4所示，以正己烷為溶劑，不同環(huán)數(shù)烷烴的大體積進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積35μL。從圖中可以看出比正己烷溶劑多兩個(gè)碳的化合物C8，并未隨溶劑蒸發(fā)損失，且高沸點(diǎn)的C40具有較好的響應(yīng)及分析精密度，進(jìn)一步證明了CSR對(duì)低沸點(diǎn)和高沸點(diǎn)化合物均無歧視效應(yīng)。

圖4.低、高沸點(diǎn)化合物無歧視

 

（3）特點(diǎn)三：簡化前處理過程，避免低沸點(diǎn)化合物濃縮時(shí)有損失

如圖5所示，在環(huán)境水體中PAHs的分析，一般需要濃縮1000倍，進(jìn)樣量為1μL，采用液液萃取和SPE小柱富集兩種方式均消耗大量溶劑，且費(fèi)時(shí)，在氮吹濃縮過程中容易造成低沸點(diǎn)PAHs的損失。因此可以采用類似液液微萃取的方式，只需1mL有機(jī)溶劑，20mL水樣，無需氮吹濃縮，萃取后可直接進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為50μL，可達(dá)到相同效果，甚至更好，既可以大大減少樣品前處理過程，并避免低沸點(diǎn)化合物的損失。同樣，在農(nóng)殘分析過程中，如JIA胺磷等低沸點(diǎn)農(nóng)藥在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹濃縮過程中也容易損失一部分，從而造成結(jié)果不準(zhǔn)確，因此可以采用CSR技術(shù)來解決這一問題。

圖5.簡化前處理過程

2典型色譜圖

圖6. std200μg/L

圖7. 95%乙醇樣品

其中樣品中氨基甲酸乙酯平行測試結(jié)果為：27.15和23.41 ng/mL，平均值為25.125 ng/mL。

3檢出限及線性相關(guān)系數(shù)R2

連續(xù)5天每天的校準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2范圍0.9997～0.9999。

表1.檢出限及線性相關(guān)系數(shù)R2

4響應(yīng)值重復(fù)性

（1）日內(nèi)重復(fù)性：將25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（含同位素內(nèi)標(biāo)）一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算TIC峰面積RSD%。分別報(bào)告氨基甲酸乙酯及同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

（2）日間重復(fù)性：將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液6天內(nèi)每天進(jìn)樣3次（每次間隔應(yīng)≥2小時(shí)），計(jì)算TIC峰面積RSD%，分別報(bào)告氨基甲酸乙酯及同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

（3）結(jié)果表明：目標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)峰響應(yīng)值日間重復(fù)性分別為2.74%、4.20%；日內(nèi)重復(fù)性分別為2.55 %、2.89%，重復(fù)性良好。

表2.響應(yīng)值重復(fù)性

5保留時(shí)間重復(fù)性

（1）日內(nèi)重復(fù)性：將25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液

（含同位素內(nèi)標(biāo)）一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算目標(biāo)峰保留時(shí)間RSD%。分別報(bào)告氨基甲酸乙酯及同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

（2）日間重復(fù)性：將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液6天內(nèi)每天進(jìn)樣3次（每次間隔應(yīng)≥2小時(shí)），計(jì)算目標(biāo)峰保留時(shí)間RSD%，分別報(bào)告氨基甲酸乙酯及同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

（3）結(jié)果表明：目標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間日間重復(fù)性為0.00、日內(nèi)重復(fù)性為0.06%，重復(fù)性良好。

表3.保留時(shí)間重復(fù)性

6系統(tǒng)抗污染能力

使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的校準(zhǔn)曲線大濃度標(biāo)樣（1 mg/mL），連續(xù)進(jìn)樣分析20次，報(bào)告響應(yīng)值重復(fù)性RSD%，次和

后一次響應(yīng)值之差的值與平均響應(yīng)值的比值。表4所示，系統(tǒng)抗污染能力目標(biāo)峰為0.02、RSD為3.44%；內(nèi)標(biāo)峰為

0.03、RSD為3.05%，系統(tǒng)抗污染能力強(qiáng)。

表4.系統(tǒng)抗污染能力

 

結(jié)論

按照GB 5009.223-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測定》，建立了ISQ-LT GC-MS結(jié)合CSR大體積進(jìn)樣技術(shù)測定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，進(jìn)樣量為13μL，考察了方法檢出限、校準(zhǔn)曲線及線性范圍、響應(yīng)值日內(nèi)日間重復(fù)性、保留時(shí)間日內(nèi)日間重復(fù)性、系統(tǒng)抗污染能力等，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在10.0～1000ng/mL濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2范圍0.9997～0.9999，線性良好；檢出限為0.033 ng/mL；響應(yīng)值日間日內(nèi)重復(fù)性2.55～4.20%

之間；保留時(shí)間日間日內(nèi)重復(fù)性0.00～0.06%之間；系統(tǒng)抗污染能力目標(biāo)峰為0.02，內(nèi)標(biāo)峰為0.03，結(jié)果良好，同時(shí)

CSR大體積進(jìn)樣技術(shù)可以提高檢出限和靈敏度，該方法滿足分析檢測的要求。

【儀器/耗材清單】

 

儀器

Thermo ScientificTM ISQ單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，包括：

-TRACE 1310氣相色譜，配分流不分流進(jìn)樣口

-ISQ LT單四極桿質(zhì)譜

- AS1310自動(dòng)進(jìn)樣器

Thermo ScientificTM TraceFinder 3.2.512.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)