【概述】

威士忌酒是一種常見的烈性酒。其蒸餾工藝歷史悠久、源遠流長，其中還涉及非常復雜的陳釀過程。具體來說，要先將多種谷物和水混合制成酒漿并利用酵母進行發(fā)酵，再進行蒸餾，然后還要在木桶或酒桶中進行陳釀。1經(jīng)過這種復雜的傳統(tǒng)工藝處理的成品酒的酒精含量很高，不過批次間的差異也巨大。舉例來講，產(chǎn)自蘇格蘭島西海岸的威士忌酒通常帶有濃重的煙熏味，而產(chǎn)自斯貝塞區(qū)的酒則富有蜂蜜，香草的香甜和濃濃果香。2制酒技術(shù)通常會對酒的化學組成產(chǎn)生重要影響，從而影響終成品酒的風味。

 

正是由于這些*之處，加之其需求的不斷增長，威士忌酒已經(jīng)成為世界上很多地區(qū)的重要商品。而整個威士忌酒業(yè)也成為這些地區(qū)的雇傭主體和稅收支柱。舉個例子，對于英國經(jīng)濟來說，威士忌酒業(yè)的市場價值約為50億英鎊，3而整個烈酒市場在美國的價值總和約為1200億美元。4由于威士忌酒零售價格普遍較高，市面上充斥著大量偽劣商品，對威士忌酒業(yè)的生存和發(fā)展構(gòu)成相當大的威脅。造假的手段五花八門，規(guī)模大小不一。普遍的一種方式是將威士忌酒的主要已知化學成分加入某種低價烈酒中，以這種“人造產(chǎn)品”冒充威士忌。這種方式也令人擔心，因為造假者根本不可能規(guī)范控制化學物質(zhì)添加的種類、質(zhì)量和濃度。

 

另一種造假的主要形式是以次充好，夸大威士忌酒陳釀的年數(shù)。因為威士忌的顏色深度跟陳釀的年數(shù)正相關(guān)，造假者會在酒中添加色素或在陳釀過程中加熱以模仿陳釀的色澤，或在灌裝時故意使用不相符的標簽來夸大陳釀的年數(shù)來在市場上謀取暴利。這兩種造假的方法都能夠快速地在數(shù)月甚至數(shù)日之中得到正常需要數(shù)年才能得到的酒品外觀。

 

因此，對威士忌酒釀造商來說，能夠使用現(xiàn)有的分析技術(shù)準確、全面地表征他們的產(chǎn)品至關(guān)重要，因為這樣有助于對假貨的準確識別和整治，使得他們能夠有效地保護自己的產(chǎn)品和品牌。此外，對于威士忌酒釀造商來說，把產(chǎn)品的化學輪廓描繪分析納入質(zhì)控流程的好處還不止于此。因為化學輪廓分析的結(jié)果還有助于他們比較不同批次產(chǎn)品的差異，及時發(fā)現(xiàn)釀造過程中出現(xiàn)的變化。這樣一來，他們就能更有效地保證他們灌裝的成品酒品質(zhì)始終如一，符合消費者期待的特色風味和特征。

【實驗/設(shè)備條件】

表2. GC和進樣器條件

表3.質(zhì)譜儀條件

【樣品提取】

 

本研究中共包括了九種威士忌酒樣品，樣品詳細信息參見表1。為GC分析進行的樣品前處理程序如下：將3 mL威士忌酒樣品與10 mL蒸餾水混合，再加入15 mL乙酸乙酯振蕩，將有機相通過3 g硫酸鈉。在室溫下借助溫和氮氣流吹干乙酸乙酯萃取液，再用0.5 mL乙酸乙酯重懸并轉(zhuǎn)移至GC樣品瓶內(nèi)。

將每種酒的萃取液取50 µL在GC樣品瓶中進行混合，制成復合樣品以進行統(tǒng)計分析。此外，以空白乙酸乙酯樣品作為對照，以排除背景中存在的峰。對每個樣品，包括復合樣品，以隨機順序進行四次重復進樣分析。

表1.研究涉及的威士忌酒樣品詳細信息

【實驗/操作方法】

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）被廣泛用于的威士忌酒表征分析，因為它具有色譜分辨率好、重現(xiàn)性高、峰容量高等優(yōu)點，尤其是成熟的GC-MS數(shù)據(jù)庫能非常有效地幫助實現(xiàn)酒中揮發(fā)性和半揮發(fā)性化學成分的鑒定。在本概念驗證性研究中，我們希望利用Thermo Scienti?cTM Q ExactiveTM GC混合四極桿-OrbitrapTM質(zhì)譜儀出色的分析表現(xiàn)來對不同產(chǎn)地、年份、和類型的威士忌酒進行輪廓描繪分析。

 

本研究的另一個目標是對使用Q Exactive GC系統(tǒng)，通過一個完整的非定靶化學計量工作流程，進行威士忌酒中化學成分的檢測和鑒定的方法和效果進行評估。本文中也可見不同產(chǎn)地威士忌酒的化學成分存在差異。

樣品分析在高質(zhì)量分辨能力下使用全掃非定靶采集方式進行，以獲得質(zhì)量數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)對于實現(xiàn)元素組成分析、區(qū)分樣品與共洗脫等質(zhì)量干擾化合物非常重要。高掃速與大動態(tài)定量范圍和高靈敏度的組合使得檢測高、低豐度的成分都易如反掌。這些特性與*軟件算法的結(jié)合能夠支持自動解卷積，并完成數(shù)據(jù)的解析和樣品對比，為酒品的全面分析、質(zhì)量控制、和品牌管理保護提供了強大的工具支撐。

【實驗結(jié)果/結(jié)論】

驗證性研究的目的是使用非定靶全掃數(shù)據(jù)采集法分析威士忌酒樣品、使用統(tǒng)計工具鑒定樣品間是否存在差異，并初步鑒定出所有觀察到的差異物質(zhì)。此外，另一個目的是通過質(zhì)量數(shù)推理和譜圖匹配對每個樣品進行化學成分表征。圖1總結(jié)了達成這些目標所需的工作流程。

圖1.用Q Exactive GC系統(tǒng)進行化學輪廓描繪和標志物鑒定的工作流程

 

發(fā)現(xiàn)樣品間的差異

對每個樣品進行四次重復進樣分析并獲得全掃色譜圖。圖2給出了一份單一純麥樣品和一份波本威士忌酒樣品的總離子流圖（TICs）實例，圖中可見大量不同強度的峰出現(xiàn)在各個保留時間。對化學輪廓描繪分析來說非常重要的一點是，Q ExactiveGC系統(tǒng)的動態(tài)定量區(qū)間范圍非常大，使得同時準確捕捉痕量成分和高濃度成分成為可能。用SIEVE 2.2軟件處理全部數(shù)據(jù)，包括9份樣品、復合樣品、和重復分析的數(shù)據(jù)，進行組分提取和統(tǒng)計分析。軟件會首先進行色譜峰對齊操作以校正分析間的保留時間漂移，然后再進行譜峰檢測和后的統(tǒng)計分析。分析結(jié)果參見圖3，圖中顯示的是對所有樣品和重復分析結(jié)果進行主成分分析（PCA）的結(jié)果。目測來看，每份威士忌酒樣品的重復分析數(shù)據(jù)顯然聚類在一起，而混合樣品如預期般位于PCA圖的中心位置。

圖2.純麥威士忌酒（樣品2265）和波本威士忌酒（樣品2295）的GC-MS總離子流譜圖.

圖3.將9份威士忌酒樣品進行4次重復分析的數(shù)據(jù)由SIEVE軟件進行主成份分析所得模型。請注意，所有的重復分析數(shù)據(jù)都正確地聚類在一起。而威士忌酒樣品2295（波本威士忌）和2265（在三個酒桶中進行過陳化）雖然與其它樣品明顯不同，但彼此卻有相似之處。

分離*成分

基于PCA分析結(jié)果和SIEVE 2.2生成的譜峰列表，我們可以分析不同樣品類型之間的差異主要是由哪些峰造成的。從

PCA分析中得到的一個有趣結(jié)果是樣品2295和2265與其它樣品明顯有差異。對含有4841個組分的列表（包含保留時間和相應(yīng)的質(zhì)量數(shù)）根據(jù)p值（<0.05）進行排序以保證統(tǒng)計上的顯著性，結(jié)果有效揭示出樣品2295中有大量*化合物和這些化合物濃度顯著升高、并且在四份重復分析中顯示出一致的組分峰。我們對統(tǒng)計差異位列前五的譜峰進行了分析，結(jié)果參見表4。

 

具體來說,如SIEVE 2.2的強度變化趨勢圖（圖4）所示，首先發(fā)現(xiàn)保留時間13.6分鐘處的譜峰在樣品2295中顯著高于所有其它樣品。下一步是根據(jù)質(zhì)量數(shù)推測元素組成，嘗試鑒定出組分峰化學結(jié)構(gòu)。這一步可能會非常困難，同時使用EI譜圖和PCI譜圖會有些幫助。還可以用EI譜圖去搜索諸如NIST等商用譜圖數(shù)據(jù)庫以得到可能的化合物，并使用準確質(zhì)量信息來支持或排除鑒定結(jié)果。如果EI譜圖搜不出結(jié)果，可以用PCI數(shù)據(jù)推測分子離子可能的元素組成。的質(zhì)量準確度對于縮減可能的化學分子式列表和提高鑒定結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。

表4.樣品2295中濃度升高的五個譜峰及其可能的鑒定結(jié)果總結(jié)表

 

為簡化13.6分鐘處譜峰的鑒定，將原始數(shù)據(jù)用TraceFinder軟件解卷積化生成一張更為“干凈”的譜圖，然后再與NIST 14進行搜索匹配（圖5）。搜索NIST譜庫所得結(jié)果再根據(jù)正匹配指數(shù)（SI）得分和高分辨過濾分值（HRF）進行評分。HRF值實際上就是搜庫所得化學分子式所能解釋的譜圖比例。以佳結(jié)果反式β-紫羅蘭酮為例，譜圖中高達98.4%的內(nèi)容都可以根據(jù)離子的準確質(zhì)量找到解釋。譜圖中觀察到的碎片離子也都可以匹配到推斷化合物的結(jié)構(gòu)單元上，更提高了鑒定結(jié)果的可信度，也有助于解釋這些碎片是如何在推測化合物的基礎(chǔ)上形成的。后SI和HRF的綜合得分為75.3%。圖6顯示的是EI譜圖中的碎片離子峰，圖中標記出了推測分子元素組成和質(zhì)量偏差。所有碎片離子的實測值和理論值之差都在小于1 ppm，使得結(jié)果更為可靠。反式β-紫羅蘭酮是胡蘿卜素的裂分產(chǎn)物，其濃度在樣品2295（波本威士忌酒）中有顯著升高。波本威士忌和蘇格蘭威士忌的一個重要區(qū)別在于，波本威士忌是用玉米而不是大麥釀制的。玉米中天然β-胡蘿卜素的含量高于大麥（玉米含量為53 µg/200 g，大麥含量為7 µg/200g5），因此檢測到的濃度差異可以在這里找到解釋。

圖5. 13.6分鐘處的峰被鑒定為反式β-紫羅蘭酮。TraceFinder 3.3中解卷積化數(shù)據(jù)及譜庫搜索結(jié)果的截屏圖。譜庫搜索結(jié)果列表，排的結(jié)果，反式β-紫羅蘭酮，能解釋75.3%的譜圖內(nèi)容（上圖）。實采譜圖與數(shù)據(jù)庫譜圖的鏡像比較圖（下圖）。

圖6.標記了分子式和質(zhì)量偏差（ppm）的反式β-紫羅蘭酮EI碎片譜圖。分子離子和前六個強度高的碎片支持鑒定結(jié)果，質(zhì)量準確度< 1 ppm。R =分辨率。

圖7. 18.00分鐘處譜峰的EI圖，譜庫搜索未產(chǎn)生匹配結(jié)果。圖中標注出了每個峰的結(jié)構(gòu)、分子式和質(zhì)量偏差（ppm）。質(zhì)量偏差小于1 ppm，使得鑒定結(jié)果，3-羰基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸，高度可信。譜峰注釋根據(jù)Mass Frontier 7.0中生成的結(jié)果進行。

圖8. SIEVE軟件對同一釀酒廠不同陳化年份的威士忌酒生成的PCA圖。重復進樣分析結(jié)果一致。

 

產(chǎn)自同一釀酒廠的威士忌酒間的差異

對本次研究產(chǎn)生數(shù)據(jù)的進一步分析是比較同一間釀酒廠出產(chǎn)而陳化年份或陳化過程不同的威士忌酒之間的差異。使用SIEVE軟件對樣品2263（12年）、2264（18年）、和2265（未標明年份，但已知是在三個不同的酒桶中進行過陳化）的重復分析數(shù)據(jù)進行分析，PCA結(jié)果顯示這三份樣品間存在明顯差異，而重復進樣分析的結(jié)果則一致（圖8）。

在TraceFinder軟件中能夠迅速分離出造成這些差異的化合物：通過用熱圖形式展示解卷積化的譜峰列表（圖9），樣品間峰高的差異一目了然，可以輕松挑選出研究者感興趣的譜峰。

TraceFinder根據(jù)譜圖匹配和質(zhì)量對推測的化合物列表進行排列，鑒定結(jié)果為羥甲基呋喃醛（圖10）。具體來說就是該軟件先根據(jù)推測化合物結(jié)構(gòu)能夠在質(zhì)量層面解釋多少譜圖內(nèi)容進行評分，當搜索指數(shù)（> 600），后按這兩個參數(shù)排序找到吻合的結(jié)果。威士忌酒中出現(xiàn)羥甲基呋喃醛（HMF）并不令人意外，因為該化合物是糖脫水的產(chǎn)物。6，7樣品2265曾在三個不同的酒桶中進行陳化，其中包括曾釀過高糖分的雪莉酒和波本威士忌的酒桶，因此其中羥甲基呋喃醛濃度高企很可能是由于威士忌酒與酒桶內(nèi)表面相互作用造成的。尤其是已知波本威士忌橡木酒桶的受熱碳化會導致HMF濃度的升高。

結(jié)論

驗證性研究的結(jié)果顯示，使用Thermo Scienti?c Q ExactiveGC混合四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀與TraceFinder和SIEVE 2.2軟件組合能夠非常有效地對復雜樣品進行化學輪廓描繪分析。Orbitrap質(zhì)譜儀能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中所有組分的高質(zhì)量準確度檢測，使得對樣品快速、可靠、不局限于組分濃度的表征成為可能。

•可靠、高度重復性的色譜分離與高速數(shù)據(jù)采集能力的組合使Q Exactive GC系統(tǒng)成為一個進行復雜樣品化學輪廓分析的理想平臺。

•常規(guī)保證的60,000 FWHM分辨率與足夠?qū)挼亩縿討B(tài)范圍消除了質(zhì)量數(shù)相同（低分辨質(zhì)譜不能分辨）物質(zhì)干擾的煩惱，加之穩(wěn)定的1 ppm以內(nèi)的質(zhì)量準確度和的靈敏度，大大提高了復雜基質(zhì)中化合物鑒定結(jié)果的可靠度。

•SIEVE 2.2與TraceFinder軟件使得快速、全面的威士忌酒樣品表征易如反掌，化合物分離鑒定結(jié)果準確可信。

•EI和PCI數(shù)據(jù)可以用來搜索商用譜庫并進行初步的化合物鑒定分析。而當譜庫搜索無果時，準確質(zhì)量數(shù)據(jù)也使得推測元素組成有根有據(jù)。而推測的鑒定結(jié)果也能夠在Mass Frontier7.0中根據(jù)碎片離子的準確質(zhì)量快速進行確認或排除。

【儀器/耗材清單】

所有實驗均使用賽默飛Q Exactive GC系統(tǒng)進行。進樣使用Thermo Scienti?cTM TriPlusTM RSH自動進樣器，色譜分離使用ThermoScienti?cTMTriPlusTM1310 GC，搭配Thermo Scienti?cTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 30 m×0.25 mm I.D.×0.25 µm薄層毛細管色譜，帶10 m預柱（P/N 26096-1425）。