三聚氰胺（Melamine）含氮量為66.6％，折合成粗蛋白含量為416.27%，加入寵物飼料和牛奶中可以大幅提高蛋白質(zhì)測(cè)定表觀含量，但食用后可誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，因此一直禁止在飼料和食品中使用。2007年，國(guó)內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月，國(guó)內(nèi)發(fā)生奶粉中三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。

目前對(duì)于三聚氰胺的檢測(cè)，常規(guī)的方法為L(zhǎng)C方法。但由于該化合物含有三個(gè)有機(jī)氮基團(tuán)，極性強(qiáng)，在普通C18反相柱上難以保留，無法達(dá)到分離效果。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的HPLC方法基本都須加入離子對(duì)試劑以增加三聚氰胺的保留，但辛烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑恰恰限制了LC-MS的應(yīng)用。本文采用新型的SCX-C18混合填料色譜柱測(cè)定三聚氰胺，該柱內(nèi)填充的是均勻混合的SCX和普通C18填料顆粒，兼具離子交換和反相分離的特點(diǎn)，檢測(cè)中不需加入離子對(duì)試劑，還可應(yīng)用與LCsolution聯(lián)機(jī)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。

儀器概況
本實(shí)驗(yàn)使用島津Prominence LC-20A液相色譜儀系統(tǒng)。LC-20A是島津制作所投入整體力量開發(fā)的新一代液相色譜儀，具有以下特點(diǎn)：*的基本性能，輕松滿足客戶對(duì)儀器嚴(yán)格的要求；全自動(dòng)化操作，實(shí)現(xiàn)了分析的率；高度對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)要求的綜合管理系統(tǒng)，改善分析工作環(huán)境。

本次實(shí)驗(yàn)所用儀器的具體配置為L(zhǎng)C-20AD輸液泵，DGU-20A3在線脫氣，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見檢測(cè)器，CBM-20A控制器和LCsolution色譜工作站。

分析方法
色譜柱：CAPcell Pak CR(1:4) 4.6×150mm 5μm
檢測(cè)波長(zhǎng)：243nm
流動(dòng)相：15mM醋酸銨緩沖液(pH3.0):乙腈=7:3
流速：1.2mL/min
柱溫：30℃
進(jìn)樣量：10μL
洗脫方式：等度洗脫。

樣品前處理方法
　　取奶粉樣品0.5g，準(zhǔn)確加入5mL三氯YI酸溶液和0.2mL乙酸鉛溶液，搖勻，超聲提取20min。轉(zhuǎn)入離心管，在10000r/min離心機(jī)上離心5min，取上清液, 0.45μm濾膜過濾，上機(jī)測(cè)定。

分析結(jié)果
1.保留時(shí)間與峰形
　　圖1為本方法檢測(cè)三聚氰胺標(biāo)樣的典型色譜圖（樣品濃度為5ug/mL）

圖1 三聚氰胺標(biāo)樣圖譜

　　由圖1可見，本方法所測(cè)三聚氰胺保留時(shí)間為9.38min，峰形尖銳，對(duì)稱性好。
2.精密度
　　取濃度為5μg/mL三聚氰胺標(biāo)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示。

編號(hào)	保留時(shí)間(min)	峰面積(μV.S)
1	9.378	113178
2	9.388	112902
3	9.397	112677
4	9.397	112874
5	9.409	112909
Average	9.394	112908
%RSD	0.12	0.16

表1 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性

　　由表1結(jié)果可見，本方法測(cè)定三聚氰胺具有良好的精密度和重現(xiàn)性。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　取標(biāo)準(zhǔn)品，用緩沖液稀釋成濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣，得到校準(zhǔn)曲線(見圖2)。

圖2 校準(zhǔn)曲線

　　結(jié)果表明，該方法線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999。
4.加標(biāo)回收率
　　取奶粉空白樣品，加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，使奶粉中終含量分別為0.5mg/kg、5mg/kg和50mg/kg，結(jié)果如下：

圖3 空白奶粉

圖4 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺

圖5 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺

圖6 空白奶粉添加50mg/kg三聚氰胺

　　加樣回收率結(jié)果如表2所示。

 

加樣量(mg/kg)	計(jì)算結(jié)果(mg/kg)	回收率 %	平均回收率%
0.5	0.55	109.3	115
	0.60	120
5.0	4.56	91.2	92.9
	4.72	94.5
50	48.6	97.2	97.8
	49.2	98.4

 

表2 3個(gè)不同濃度樣品回收率

5.檢測(cè)限和定量限
　　用軟件計(jì)算出奶粉中三聚氰胺含量檢測(cè)限為0.43mg/kg ，定量限為1.31mg/kg。
6.實(shí)際樣品分析結(jié)果
　　按本方法測(cè)定某品牌的奶粉，得到的圖譜如圖7所示。兩份重復(fù)樣品中測(cè)得三聚氰胺的濃度分別為19.7和19.8mg/kg，重現(xiàn)性良好。(用反相離子對(duì)色譜法測(cè)得的兩次結(jié)果分別為19.1和19.2 mg/kg)

圖7 某品牌陽性樣品檢測(cè)結(jié)果

結(jié)論
　　本方法定量限為1.31mg/kg，具有操作簡(jiǎn)單方便，靈敏度較高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。流動(dòng)相中不用加入離子對(duì)試劑，為L(zhǎng)CMS的分析提供了可能。且樣品經(jīng)提取后可不用經(jīng)過SPE步驟即可進(jìn)樣，大大簡(jiǎn)化了分析過程，節(jié)省了分析成本。本方法適合奶粉中三聚氰胺含量的測(cè)定，特別是大批量樣品的低成本快速檢測(cè)。