緩激肽是一種含有9種氨基酸的生理和藥理活性肽，由蛋白質(zhì)的激肽基團(tuán)衍生而來(lái)（圖1）。激肽是可以促使血管舒張、血管通透性增強(qiáng)、一氧化氮釋放和花生四烯酸流動(dòng)的效應(yīng)因子。它是血壓、腎功能和心臟功能的重要調(diào)節(jié)因子，還參與炎癥反應(yīng)1 。緩激肽可引起血管擴(kuò)張，從而導(dǎo)致血壓降低。因此，對(duì)這種激素肽的變化進(jìn)行高靈敏度、高選擇性和高準(zhǔn)確度地定量，并將其作為疾病進(jìn)展或藥物治療的評(píng)估指標(biāo)，將會(huì)極為有利。盡管以往都是通過(guò)配體結(jié)合試驗(yàn)（LBAs）對(duì)生物制劑進(jìn)行定量分析，但在過(guò)去幾年中利用LC-MS/MS分析大分子已成為一種趨勢(shì)。這在某種程度上是因?yàn)長(zhǎng)BAs產(chǎn)生顯著的交叉反應(yīng)問(wèn)題并且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。沃特世液質(zhì)LC-MS/MS具有多種優(yōu)勢(shì)，例如開發(fā)時(shí)間更短、準(zhǔn)確度和精度更高、可重復(fù)進(jìn)樣，并且容易區(qū)分相似度很高的類似物、代謝物或內(nèi)源性干擾物。常見的肽通常難以通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行分析，這是因?yàn)槠洳灰纂x子化以及不易產(chǎn)生理想的碎片離子而導(dǎo)致MS靈敏度較低，從而使得 LC和樣品制備方法開發(fā)非常困難。由于緩激肽在血漿中的濃度低至pg/ mL水平且代謝速度快，在采血和樣品制備過(guò)程中還可通過(guò)蛋白水解人為生成，因此對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量相當(dāng)困難。

 

本研究采用了專門設(shè)計(jì)的血液收集技術(shù)以防止體外緩激肽的形成，并且利用混合型固相萃?。⊿PE）和高效實(shí)心核顆粒色譜柱，大限度降低并消除基質(zhì)干擾的同時(shí)提高定量分析的靈敏度。

 

在m/z 531和m/z 354觀察到緩激肽的2+和3+母離子。緩激肽（圖A）和IS（圖B）的3+母離子的典型MS/MS譜圖如圖3所示。在方法開發(fā)過(guò)程中，記錄了一些不同的多電荷母離子和碎片離子。終使用了緩激肽和IS的3+母離子，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨|(zhì)中強(qiáng)度高且選擇性佳。選擇m/z 419.18 y31+的碎片離子作為緩激肽定量分析的主要碎片離子。選取3+母離子和m/z 408.18 b41+碎片離子用于確證。對(duì)于IS，選擇了m/z 344.94的3+母離子和m/z 386.03 b72+碎片離子。MS條件如圖2 所示。盡管許多肽可以生成小于m/z 200的較強(qiáng)碎片離子，但在提取樣品中這些離子（通常為亞胺離子）由于缺乏特異性，會(huì)導(dǎo)致高背景噪音。在此檢測(cè)中，采用m/z值大于其母離子的高特異性b或y碎片離子顯著提高了特異性，便于使用更為簡(jiǎn)單的LC和SPE方法。

 

結(jié)論：本研究開發(fā)了一種用于提取人血漿中緩激肽的混合模式 SPE提取方法。μElution SPE提取板消除了蒸發(fā)操作需求，并且利用非特異性結(jié)合和樣品濃縮而大大降低了損失的可能性。通過(guò)一種快速、簡(jiǎn)單、分析級(jí)的LC方法將緩激肽與相似度很高的內(nèi)源性干擾物分離開來(lái)，LC總運(yùn)行時(shí)間僅為 3.5分鐘。與傳統(tǒng)的C18全多孔色譜柱相比，CORTECS UPLC C18 實(shí)心核顆粒色譜柱改善了峰形，提高了緩激肽檢測(cè)的靈敏度。CORTECS UPLC C18色譜柱、混合型弱陽(yáng)離子交換SPE以及 m/z較高的b或y MS碎片離子的聯(lián)合使用提供了理想的選擇性和靈敏度水平，從而實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確定量并從200 μL血漿中區(qū)分緩激肽濃度細(xì)微差異。標(biāo)準(zhǔn)曲線在5-10000 pg/mL的范圍內(nèi)準(zhǔn)確精密。在高于基底濃度的情況下可精確定量的緩激肽低濃度為5 pg/mL。所有濃度的QC樣品均符合FDA法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)4,5 ，平均準(zhǔn)確度范圍為99.8-106.8，平均CV%為0.5- 5.5。以上數(shù)據(jù)證實(shí)了這是一種準(zhǔn)確且可重現(xiàn)的方法。本研究還證實(shí)了采用合適的蛋白酶抑制劑樣品收集方式對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定緩激肽內(nèi)源性濃度的重要性。此外，如果需要執(zhí)行進(jìn)一步驗(yàn)證，本方法在通過(guò)LC-MS/MS對(duì)PK和臨床研究的患者樣品進(jìn)行高靈敏度的緩激肽定量方面也表現(xiàn)出巨大的潛力。