應(yīng)用優(yōu)勢(shì) ■ 教學(xué)式系統(tǒng)展示LC系統(tǒng)擴(kuò)散對(duì)mAb的SEC 分離的影響 ■ 指導(dǎo)用戶根據(jù)所使用的LC系統(tǒng)和分析方法要求(包括分離度、靈敏度、重現(xiàn)性和可轉(zhuǎn)換性)選擇SEC色譜柱配置 ■ 展沃特世ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio和 ACQUITY Arc™ Bio系統(tǒng)的SEC分離性能

 

簡(jiǎn)介過(guò)去，體積排阻色譜(SEC)是評(píng)估重組蛋白生物治療藥物中非共價(jià)蛋白質(zhì)聚集體 (高分子量物質(zhì)[HMWS])時(shí)應(yīng)用廣泛的方法1 。但近年來(lái)，由于SEC色譜柱和LC 系統(tǒng)的性能提升，使用SEC對(duì)這些樣品中的蛋白質(zhì)片段(低分子量物質(zhì)[LMWS]) 在非變性的條件下進(jìn)行分析的方法也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。其中受關(guān)注的，是針對(duì)鉸鏈區(qū)水解降解所產(chǎn)生IgG單克隆抗體(mAb)片段的分析方法2 。相較于將單體(約150 KDa)與二聚體和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分離的傳統(tǒng)分離方法，LMWS片段(分子量為mAb單體分子量三分之二(約100 KDa)的mAb主要形式)的分離可能更具挑戰(zhàn)性。這是由于LMWS與單體的大小 (流體動(dòng)力學(xué)半徑)相比于單體與HMWS蛋白質(zhì)的大小更加接近。由于蛋白質(zhì)洗脫順序中低濃度LMWS峰作為主(單體)峰上的拖尾肩峰洗脫，使分離難度進(jìn)一步增加。

 

雖然使用粒徑為亞2 µm的SEC色譜柱能夠提高效率，從而提高HMWS和LMWS 的分析通量，但由于色譜柱硬件和填料的限制，這些高柱效SEC顆粒僅適用于內(nèi)徑為4.6 mm或更小的色譜柱。使用HPLC色譜系統(tǒng)時(shí)，通常因?yàn)镾EC粒徑為3 µm 及以上，可以選擇7.8 mm內(nèi)徑的色譜柱。雖然許多HPLC系統(tǒng)也能夠在這些內(nèi)徑為4.6 mm的SEC色譜柱所需流速和背壓下運(yùn)行，但存在一個(gè)經(jīng)常被忽視的事實(shí)，即典型HPLC配置的柱外擴(kuò)散相對(duì)大于這些UPLC SEC色譜柱所產(chǎn)生的峰體積，導(dǎo)致觀察到的峰分離度明顯降低3 。柱外擴(kuò)散可以看作是樣品在通過(guò)不含色譜柱的LC系統(tǒng)流路時(shí)發(fā)生的體積增加現(xiàn)象。

 

本研究的目的是系統(tǒng)性評(píng)估SEC粒徑、色譜柱柱長(zhǎng)和內(nèi)徑以及LC系統(tǒng)柱外擴(kuò)散對(duì)mAb的HMWS和LMWS的分離度的影響，文中所述基本原理適用于其它蛋白質(zhì)的SEC分析。此外，還將演示系統(tǒng)擴(kuò)散對(duì)LMWS的檢測(cè)下限和定量結(jié)果可靠性的不良影響。綜上，提供與 Waters™ LC儀器兼容的色譜柱的選擇建議。

測(cè)定系統(tǒng)擴(kuò)散色譜分析的一條基本原理是：色譜柱以外發(fā)生的柱外擴(kuò)散或柱外色譜峰/譜帶展寬始終會(huì)對(duì)分離度造成不良影響。在許多蛋白質(zhì)和肽的梯度分離(例如反相和離子交換)中，分析物在上樣條件下與固定相強(qiáng)力結(jié)合，并在柱床的頭部重新濃縮，然后開(kāi)始梯度洗脫。這些梯度分離方法，能夠大程度削弱甚至消除柱前譜帶擴(kuò)散造成的不良影響，使分析人員的主要關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)向峰從色譜柱洗脫后發(fā)生的擴(kuò)散。與此相反，在理想的SEC分離中，蛋白質(zhì)樣品和SEC顆粒表面不發(fā)生結(jié)合。對(duì)于SEC分離的實(shí)際情況是，柱前擴(kuò)散與柱后擴(kuò)散一樣會(huì)降低分離質(zhì)量。因此，評(píng)估樣品在通過(guò)不含色譜柱的LC系統(tǒng)后體積和曲線的變化可能十分有用。

 

柱外擴(kuò)散(系統(tǒng)譜帶展寬)的測(cè)定已得到廣泛研究。感興趣的讀者可以參閱本應(yīng)用紀(jì)要的姊妹篇《評(píng)估LC系統(tǒng)擴(kuò)散對(duì)體積排阻色譜分析蛋白的影響》 (沃特世應(yīng)用紀(jì)要，部件號(hào)：720006337ZH)，其中更全面地討論了系統(tǒng)擴(kuò)散及其測(cè)定，并額外展示了有關(guān)柱外擴(kuò)散對(duì)SEC分離影響的實(shí)驗(yàn)。本文測(cè)定了5σec擴(kuò)散體積(根據(jù)4.4%峰高處峰寬)，如圖1 所示。從圖2所示擴(kuò)散曲線可見(jiàn)，柱外擴(kuò)散峰不對(duì)稱(曲線存在明顯的拖尾或偏斜)，因此峰寬測(cè)定位置越接近基線，受峰拖尾的影響可能就越大。因此，選擇使用4.4%峰高處峰寬來(lái)測(cè)定5σ峰值雖然有些武斷，但這是大多數(shù)常用色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)(例如 Waters Empower 3和Agilent ChemStation)所提供的峰高百分比處的峰寬。通過(guò)在色譜柱入口側(cè)增加樣品定量環(huán)，ACQUITY UPLC H-Class Bio 系統(tǒng)上發(fā)生的各種柱外擴(kuò)散情況如圖2所示