前言：紫外-可見分光光度計(jì)測量為樣品的質(zhì)量控制檢查提供了一種快速可靠的方法。它們 還可用于計(jì)算比活性或估算純化后的產(chǎn)率，并鑒定含有蛋白質(zhì)和氨基酸的組分。 含有芳香側(cè)鏈氨基酸的蛋白質(zhì)，在接近 280 nm 處產(chǎn)生吸收。因此可以使用紫外-可 見分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。當(dāng)吸收系數(shù)已知時，可根據(jù)比爾-朗伯定律 (1) 確定含 有這些氨基酸的蛋白質(zhì)的濃度。通常蛋白質(zhì)的樣品量有限，以最少體積進(jìn)行測量對 于樣品的保存至關(guān)重要。通過波長掃描可提供潛在污染物的信息。 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)具有光學(xué)準(zhǔn)直的集成式多池支架，與超微 量比色皿（圖 1）配合使用，非常適用于可靠且可重現(xiàn)的定性及定量測量。

本研究展示了Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)在小體 積蛋白質(zhì)樣品定性和定量分析方面的優(yōu)勢。牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 是常用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，其吸收 系數(shù)已知，我們將其用于本分析中。

實(shí)驗(yàn)部分 樣品 配制 pH 7.0 的 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液 (PBS)。配制 10 mg/mL BSA 儲備液，并稀釋至 0.75、1.50、2.25、3.00 和 3.75 mg/mL。 使用六個孔徑為 2 × 2.5 mm，容積 70 µL，光程 10 mm 的超 微量比色皿進(jìn)行測量（圖 1）。其中，一個作為參比，五個作 為樣品。使用 3.5 mL、10 mm 光程的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿進(jìn)行重 現(xiàn)性測量。采用 PBS 緩沖液作為參比溶液。 儀器和方法 所有測量均使用 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)。在 250–350 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，信號采集平均時間為 1 秒， 數(shù)據(jù)間隔為 1 nm。無需預(yù)先校準(zhǔn)系統(tǒng)。為證明重現(xiàn)性，用超微量比色皿 (70 µL) 重復(fù)測量 3.0 mg/mL BSA 溶液 20 次，其中參比位置為裝有 PBS 緩沖液的相同超微 量比色皿。此外，使用 3.5 mL、10 mm 光程的標(biāo)準(zhǔn)石英比色 皿對同樣的溶液進(jìn)行另外 20 次重復(fù)測量，以裝有 PBS 緩沖液 的相同比色皿作為參比。這些測量均在 278 nm 處進(jìn)行，信號 采集平均時間為 1 秒，光譜帶寬為 2 nm。

結(jié)果 同步測量 空白樣品和五種濃度 BSA 樣品在 Cary 3500 多池紫外-可見 分光光度計(jì)中使用超微量比色皿（2 × 2.5 mm 孔，10 mm 光 程）進(jìn)行同步測量。在 250–350 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描以 定性分析樣品（圖 2）。然后將這些數(shù)據(jù)用于評估儀器的線性 （參見下文微量池部分中的線性）。

蛋白質(zhì)純度 350 nm 處的吸收強(qiáng)度可用于定量和校正存在于蛋白質(zhì)樣品中 的任何污染物。從圖 2 可以看出，該測量樣品在 350 nm 處的 吸光度為 0 Abs。因此，這些樣品中 BSA 的濃度與光譜圖的峰 最大值成正比，根據(jù)這一關(guān)系可準(zhǔn)確測定 BSA 的濃度。無需 雜質(zhì)校正。 微量池線性 很明顯，每個 BSA 波長掃描的峰最大值均出現(xiàn)在 278 nm 處 （圖 2）。使用 Cary 紫外工作站軟件提取每個樣品在 278 nm 處峰的吸收強(qiáng)度，并將其對每種所測樣品中的蛋白質(zhì)濃度作圖 （圖 3）。這些數(shù)據(jù)清晰地展示了 Cary 3500 系統(tǒng)的線性 （圖 3）。結(jié)果表明，線性范圍擴(kuò)展至接近 2.5 Abs，即使使用 小孔超微量比色皿也是如此。

重現(xiàn)性 為證明重現(xiàn)性，在 70 µL、2 × 2.5 mm 孔徑的超微量比色皿或 3.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)比色皿中重復(fù)測量 3.0 mg/mL BSA 樣品 20 次。 兩種比色皿的光程均為 10 mm。超微量比色皿較小的窗口孔 徑尺寸對測量的重現(xiàn)性（標(biāo)準(zhǔn)偏差）無影響，如圖 4 所示。 70 µL 超微量比色皿的測量標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.00042，3.5 mL 標(biāo)準(zhǔn) 比色皿為 0.00029。使用超微量比色皿測得的吸光度平均值為1.863 Abs。使用 3.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)比色皿測得的吸光度平均值為 1.858 Abs。兩種比色皿所得結(jié)果的差異在儀器的測量不確定 度范圍內(nèi)。

使用小體積比色皿的風(fēng)險(xiǎn)在于較小的比色皿窗口（通常為比色 皿設(shè)計(jì)的一部分）孔徑導(dǎo)致光通量減小。光通量減少會使線性 吸光度范圍和測量重現(xiàn)性降低。Cary 3500 具有高度聚焦的光 束，可確保以最大光通量通過樣品，且重現(xiàn)性與 3.5 mL 標(biāo)準(zhǔn) 比色皿相同（圖 4）。

討論 如果已知吸收系數(shù)，可通過紫外-可見光譜圖上的最大吸收強(qiáng) 度進(jìn)行定量測量。如此處測量的 BSA 樣品，其吸收系數(shù)已 知。如果吸收系數(shù)未知，則必須通過測量多個標(biāo)準(zhǔn)品建立校準(zhǔn) 曲線，并根據(jù)校準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算吸收系數(shù)。這是一個耗時的 過程，并可能引起在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前都無法確定的測量誤差。 分析人員可以選擇在分析序列中加入已知濃度的樣品來提高數(shù) 據(jù)的可靠性。這些加入的樣品充當(dāng)內(nèi)部對照。這種測量方法的 問題在于不能同時測量樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，因而在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品測 量之間各種變量可能發(fā)生改變。如本文所述（圖 2），同步進(jìn) 行樣品和標(biāo)樣測試可大大減小其他環(huán)境變量或可能影響樣品前 處理的偏差。在測量可能不穩(wěn)定的樣品時，一次測量一個樣品的方法可能會 導(dǎo)致結(jié)果錯誤。將樣品置于實(shí)驗(yàn)臺等待測量的過程中，它們的 吸光度可能會發(fā)生改變。引起這一改變的原因可能為溫度變 化、照射到溶液的光線的影響或溶液中的化學(xué)變化。這可能導(dǎo) 致定量測量時出現(xiàn)系統(tǒng)誤差。通過同步測量所有比色皿位置， Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)可消除這些不利變量，并 提高所生成結(jié)果的可靠性。同時，還可顯著節(jié)省測量時間。

結(jié)論 Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)為蛋白質(zhì)的定性和定量分 析帶來了新的可能。該系統(tǒng)采用*的非移動式整體多池支 架，專為提高分析效率和重現(xiàn)性而設(shè)計(jì)。通過同步測量八個比 色皿位置，可有效減少任何可能在后續(xù)測量過程中出現(xiàn)的不利 變量。這些特點(diǎn)共同造就了一個強(qiáng)大的分析型紫外-可見分光 光度計(jì)系統(tǒng)。 

參考文獻(xiàn) 1. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fasman, D.G., Ed. (1992). CRC Press, Boston