摘要：在藥物和精細(xì)化學(xué)品的開發(fā)和生產(chǎn)過程中，雜質(zhì)分析非常重要。本應(yīng)用簡報(bào) 表明多中心切割二維液相色譜非常適用于藥物和精細(xì)化學(xué)品雜質(zhì)分析的方法 開發(fā)。使用 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜解決方案，經(jīng)第一維分離后 所檢測到的每一個(gè)峰都被中心切割并轉(zhuǎn)移到具有不同選擇性的第二維進(jìn)行進(jìn) 一步分離。此方法能發(fā)現(xiàn)可能存在的共洗脫化合物。此外，通過向樣品添加 疑似雜質(zhì)還可確證對雜質(zhì)的鑒別。

前言 實(shí)驗(yàn)部分 在制藥和化工行業(yè)中，藥物和精細(xì)化 學(xué)品的雜質(zhì)分析具有重要意義。對于 新原料藥，ICH 指南 Q3A (R2) 規(guī)定 含量大于或等于 0.05% 的雜質(zhì)必須報(bào) 告，含量大于等于 0.1% 的雜質(zhì)必須 鑒定1 。 藥物和精細(xì)化學(xué)品的雜質(zhì)分析可通過 液相色譜分析該物質(zhì)的濃縮溶液來實(shí) 現(xiàn)。藥物或精細(xì)化學(xué)品中的雜質(zhì)通常 與主要化合物結(jié)構(gòu)相似，且相互間結(jié) 構(gòu)也相似。因此，使用具有給定選擇 性的系統(tǒng)（色譜柱-溶劑組合）可能無 法實(shí)現(xiàn)分離。該問題的一個(gè)解決方案 是將共洗脫化合物中心切割并轉(zhuǎn)移到 具有不同選擇性的分離系統(tǒng)，從而實(shí) 現(xiàn)分離。使用 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜解決方案的多中心切割二 維液相色譜，對與主要化合物共洗脫 的雜質(zhì)的分離分析能力如之前的應(yīng)用 簡報(bào)2 所述。 在雜質(zhì)分析方法開發(fā)期間，必須檢測 所有雜質(zhì)，不能有任何雜質(zhì)因與主要 化合物或其他雜質(zhì)共洗脫而被隱藏。 采用中心切割二維液相色譜可確保做 到這一點(diǎn)。1290 Infinity 二維液相色 譜解決方案可實(shí)現(xiàn)第一維分離的多個(gè) 峰的中心切割，然后將這些中心切割 儲(chǔ)存在定量環(huán)中并對儲(chǔ)存的中心切割 依次進(jìn)行第二維分析。 本應(yīng)用簡報(bào)展示了一個(gè)代表藥物化合 物的樣品的多中心切割二維液相色譜 分析。對第一維分離后所測到的每一 個(gè)峰均進(jìn)行中心切割，然后在具有不 同選擇性的第二維中進(jìn)行分離分析， 從而發(fā)現(xiàn)第一維分離中可能存在的共 洗脫物。

儀器 用于多中心切割的 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜解決方案包括以 下模塊： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 （G4220A，2 臺(tái)） • Agilent 1290 Infinity 自動(dòng)進(jìn) 樣器 (G4226A)，配備 Agilent 1290 Infinity 恒溫器 (G1330B) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A)，配備 2 位/4 通雙 向閥（二維液相色譜閥頭， G4236A） • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) （G1170A，2 個(gè)），配備帶 40 µL 定量環(huán)的多中心切割閥 （G4242-64000，2 個(gè)） • Agilent 1290 Infinity 二極管陣 列檢測器（G4212A，2 個(gè)）， 配備 10 mm 最大光強(qiáng)卡套式流 通池 (G4212-60008) 軟件 Agilent OpenLab CDS ChemStation 版軟件，版本 C.01.07 [27] 以及 Agilent 1290 Infinity 二維液相色譜采集軟件， 版本 A.01.02 [24]

色譜柱 • 第一維：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 × 150 mm, 1.8 µm（部件號(hào) 959759-902） • 第二維：Agilent Poroshell 120 Bonus-RP, 4.6 × 50 mm, 2.7 µm （部件號(hào) 699968-901）化學(xué)品 所有試劑純度均為液相色譜級(jí)。乙 腈和甲醇購自 Merck (Darmstadt, Germany)。新制超純水來自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng) (Millipak, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。 甲酸來自安捷倫（部件號(hào) G2453- 85060）。 樣品 使用添加了幾種雜質(zhì)的 N,N-二乙基間 甲苯酰胺 (DEET) 的甲醇/水 (50/50, v/v) 溶液作為樣品，代表含有一系列 雜質(zhì)的藥物。

結(jié)果與討論 在藥物或精細(xì)化學(xué)品的雜質(zhì)分析方法 開發(fā)過程中出現(xiàn)的一個(gè)重要問題是， 使用給定的方法是否能將所有雜質(zhì)與 主要化合物分離以及彼此分離，或者 是否發(fā)生共洗脫。圖 1 展示了使用 C18 柱以及水-乙腈梯度（均含 0.1% 甲酸） 的一維雜質(zhì)分析。在放大的色譜圖 中，可以觀察到主要化合物與兩種雜 質(zhì)發(fā)生了部分共洗脫。為了對該部分 共洗脫進(jìn)行分離分析并檢查每個(gè)峰可 能出現(xiàn)的共洗脫，將峰進(jìn)行中心切割 并轉(zhuǎn)移到具有不同選擇性的第二維進(jìn) 行分離。

圖 2 中的圖 A 展示了采用中央二維液相色譜閥并流配置以及兩個(gè)多中心切 割閥的多中心切割管道圖。圖 2 中的 圖 B 展示了多中心切割閥，其預(yù)先安 裝了經(jīng)過壓力測試的 40 µL 定量環(huán)。 多中心切割算法可確保最大限度減少 閥切換，并盡可能快地在第二維中分 析從第一維流出物中取出的中心切 割。對于每一次多中心切割二維液相 色譜分析，獲得的第一個(gè)中心切割在 峰駐留組件 A（圖 2A 右側(cè)的多中心 切割閥）的定量環(huán) 1 中保存。然后， 中央二維液相色譜閥切換，在第二維 中對第一個(gè)中心切割進(jìn)行分析。在第 一個(gè)中心切割的第二維分析期間，可 獲得多達(dá) 5 個(gè)中心切割并在峰駐留組 件 B（圖 2A 左側(cè)的多中心切割閥） 的定量環(huán) 1 到 5 中保存，直到它們 進(jìn)入第二維分析。在每個(gè)峰駐留組件 （多中心切割閥）中，始終需要一個(gè)定 量環(huán)分別用于第一維流出物和第二維 溶劑的流通。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)中心切割完成 第二維分析后，中央二維液相色譜閥 再次切換，多達(dá) 5 個(gè)中心切割可在峰 駐留組件 A 的定量環(huán) 1 到 5 中駐留， 而駐留在峰駐留組件 B 中的中心切割 在第二維中進(jìn)行分析。當(dāng)中心切割在 峰駐留組件中駐留時(shí)，在分析該駐留 組件中的中心切割之前將執(zhí)行沖洗梯 度，所駐留中心切割的第二維分析將 以反向駐留順序進(jìn)行。 多中心切割算法可使在第一維分析運(yùn) 行的同時(shí)，開始進(jìn)行中心切割的第二 維分析。這種方法意味著在同一分析 過程中可以重復(fù)使用定量環(huán)來進(jìn)行中 心切割，并且可以進(jìn)行比安裝的定量 環(huán)數(shù)量更多的中心切割。有關(guān)中心切 割算法、操作例程和軟件功能的更多 詳細(xì)說明，請參閱技術(shù)概述3 。

多中心切割可基于時(shí)間（中心切 割時(shí)間，例如，已知的第一維分離） 或基于峰（通過檢測第一維峰觸發(fā) 中心切割，例如，未知樣品）執(zhí)行。 圖 1 為使用基于時(shí)間的多中心切割的 雜質(zhì)分析。為了能發(fā)現(xiàn)共洗脫的樣品 組分，每種雜質(zhì)都進(jìn)行中心切割并在 第二維中進(jìn)行分析。此外，對主要化 合物的整個(gè)峰進(jìn)行三次間隔緊密的連 續(xù)中心切割。 圖 3 展示了多中心切割的方法設(shè)置。 在梯度預(yù)覽部分，可加載第一維參比 色譜圖，且可自動(dòng)生成用于中心切割 的時(shí)間段。生成的時(shí)間段可以在第二 維時(shí)間段表中進(jìn)行編輯，并且可以手 動(dòng)添加其他中心切割以更詳細(xì)地研究 目標(biāo)區(qū)域。對于雜質(zhì)的中心切割，選 擇的采樣時(shí)間為 0.40 分鐘，該時(shí)間 相當(dāng)于 200% 的定量環(huán)填充（40 µL 定量環(huán)體積，0.20 mL/min 第一維流 速）。由于定量環(huán)滿溢，定量環(huán)中已 全部填充為第一維流出物。梯度預(yù)覽 部分的放大視圖顯示了前四種雜質(zhì)的 切割時(shí)間段。橙色區(qū)域表示采樣時(shí) 間，較暗的陰影區(qū)域預(yù)測第一維流出 物中轉(zhuǎn)移到第二維的部分。為了對主 要化合物的整個(gè)峰進(jìn)行三次間隔緊密 的連續(xù)中心切割，選擇的采樣時(shí)間為 0.10 分鐘（50% 的定量環(huán)填充）。這 樣，含有主要化合物峰的第一維流出 物被全部采集而沒有任何損失

圖 4 展示了二維液相色譜中心切割查 看器中的多中心切割二維液相色譜分 析結(jié)果。上面的兩張圖為標(biāo)記有中心 切割的第一維色譜圖（左）和中心切 割表（右）。底部的左側(cè)展示了由第 二維檢測器記錄的第二維色譜圖。此 處，可以追溯采用反向駐留順序和沖 洗梯度 (F) 分析的中心切割的第二維 分析順序。在底部的右側(cè)，單個(gè)第二 維色譜圖可進(jìn)行顯示和疊加。 雜質(zhì)中心切割的第二維分析結(jié)果如 圖 5 所示。對于中心切割 4 和 11，在 第一維中部分共洗脫的化合物，可以 在第二維中得到分離。

圖 6 展示了主要化合物整個(gè)峰的三 個(gè)間隔緊密的連續(xù)中心切割的第二維 分析結(jié)果?？傮w而言，第二維分析顯 示有三種雜質(zhì)與主要化合物共洗脫。 一種雜質(zhì)可在主要化合物的整個(gè)峰范 圍內(nèi)檢測到（存在于中心切割 5 到 7 中）。第二種雜質(zhì)出現(xiàn)在中心切割 6 和 7 中，第三種雜質(zhì)在第一維中與主 要化合物部分共洗脫并在中心切割 7 中被分離。為了確定雜質(zhì)身份，可以合成疑似化 合物并在雜質(zhì)分析過程中將其添加到 樣品中。例如，在樣品溶液中加入雜 質(zhì)，該雜質(zhì)在第一維中與主要化合物 共洗脫，然后在第二維中與主要化合 物分離。圖 7 展示了樣品中添加的 雜質(zhì)含量不斷增加時(shí)，樣品的分析結(jié) 果。中心切割后，可在第二維分析中 檢測到雜質(zhì)的含量不斷增加。多中 心切割二維液相色譜可提供可靠定量 所需的線性和重現(xiàn)性，如技術(shù)概述3 所述。

結(jié)論 具有多中心切割的 Agilent 1290 Infinity二維液相色譜解決方案可實(shí)現(xiàn)第一維 分離的多個(gè)峰的中心切割，并將這些 切割轉(zhuǎn)移到具有不同選擇性的第二維 中進(jìn)行分離。本應(yīng)用簡報(bào)表明多中心 切割二維液相色譜非常適用于藥物、 精細(xì)化學(xué)品或藥物和化學(xué)品制劑的雜 質(zhì)分析方法開發(fā)。將第一維分離后檢 測到的峰轉(zhuǎn)移到第二維中進(jìn)行分離， 可以發(fā)現(xiàn)可能存在的共洗脫物。