摘要：分析與活性藥物成分 (API) 有關的低濃度雜質(zhì)對原料藥的質(zhì)量控制來說至關 重要。當雜質(zhì)與 API 的化學結構相似且濃度差異較大時，色譜分離與檢測將 變得困難。 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜解決方案可實現(xiàn)全二維液相色譜 (LC × LC)、多中心切割二維液相色譜 (MHC) 以及高分辨率采樣二維液相色 譜 (HiRes 2D-LC) 之間的輕松切換。在本應用簡報中，使用高分辨率采樣二 維液相色譜實現(xiàn)兩種緊鄰洗脫的化合物的分離，其中一種化合物濃度極低且 隱藏在其他高濃度化合物峰下。以氯二氟苯甲酸和脫酰胺胰島素分別作為標 準物質(zhì)和實際樣品進行分析。

前言：原料藥的純度分析對于藥物質(zhì)量和患 者安全來說都非常重要1 。根據(jù) ICH 指 南 Q3A(R2)，應對新原料藥中含量大 于 0.05%2 閾值（相對于 API）的雜質(zhì) 進行報告。對這些濃度下的雜質(zhì)進行 分離和檢測具有極大的挑戰(zhàn)性，尤其 當雜質(zhì)結構與活性藥物成分 (API) 具 有相似性時。 本應用簡報以相對濃度為 100% 及 0.05% 的氯二氟苯甲酸的不同異構體 為例，展示了高分辨率 (HiRes) 采樣 二維液相色譜在雜質(zhì)分離與檢測中的 應用。使用 Agilent 1290 Infinity II 高 動態(tài)范圍二極管陣列檢測器 (HDRDAD) 雜質(zhì)分析儀解決方案作為二維 檢測器可以進一步提高本應用的精度 和準確度。以脫酰胺胰島素作為實 際樣品分析，以展示高分辨率采樣 2D-LC/MS 對具有相似結構的雜質(zhì)的 檢測。此處，二維液相色譜還具備其 他優(yōu)勢，即第二維分離可作為脫鹽步 驟，避免第一維緩沖液中的高鹽含量 進入 MS 離子源造成離子抑制3 。使用 Agilent MassHunter 的第二維色譜圖 生成器查看并分析 MassHunter 中的 2D-LC/MS 數(shù)據(jù)。 在高分辨率采樣二維液相色譜中，在 選定時間范圍內(nèi)收集幾個涵蓋第一維 色譜圖中整個峰面積范圍的小體積餾 分，以此測定目標化合物，如圖 1 所 示。每次切割都駐留在采樣環(huán)中，并 在第二維中對所有切割進行連續(xù)分 析。這一模式可確保所有選定化合物 均轉(zhuǎn)移至第二維，并在其中得到分 析。這樣，選定的共洗脫化合物都經(jīng) 過高分辨率采樣處理，以在第二維中 進行分析。如技術概述4 所示，這一 操作可實現(xiàn)可靠的定量分析。

實驗部分： 設備 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜 解決方案包括以下模塊： • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高速 泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備 Infinity II 樣品冷卻裝置（選件 #100） • 兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高容 量柱溫箱 (G7116B) • 三臺 Agilent 1290 Infinity II 二極 管陣列檢測器 (G7117B)，配備 3.7 mm、10 mm、60 mm 最大光 強卡套式流通池 (G4212-60008) • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動 (G1170A) 和 2 位/4 通雙向閥 （二維液相色譜閥頭，G4236A） • 兩個 Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動 (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環(huán) 的多中心切割閥 (G4242-64000)為分析脫酰胺胰島素，將 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜解決方案與配備 安捷倫雙噴射流 ESI 離子源的 Agilent 6545 Q-TOF 聯(lián)用。為避免第一維緩 沖液中的高含量鹽進入離子源，按之 前應用簡報5 中的建議，使用時間表 進行 MS 分流閥切換，在每次第二維 分析的第一分鐘將液流引入廢液。

軟件 • 帶安捷倫二維液相色譜軟件（產(chǎn) 品版本 A.01.03 [025]）和 Agilent HDR-DAD ChemStation 插件（產(chǎn) 品版本 A.01.01 [015]）的 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 修訂 版 C.01.07 SR2 [255] • Agilent MassHunter 工作站 LC/MS 數(shù)據(jù)采集軟件，版本 B.08.00， Build 8.00.8026.0 • Agilent MassHunter 工作站定性 分析軟件，版本 B.07.00，Build 7.0.7024.0 • 用于 MassHunter 的安捷倫第二維 色譜圖生成器，修訂版 1.0.15

化學品 所有試劑純度均為液相色譜級。乙 腈和硫酸鈉購自 Merck (Darmstadt, Germany)。甲酸、磷酸、磷酸氫二鈉 以及磷酸二氫銨購自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。新制超純 水來自配置 0.22 µm 膜式終端過濾 器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水 純化系統(tǒng) (Millipak, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。5-氯-2,4-二 氟苯甲酸、3-氯-2,4-二氟苯甲酸、 2-氯-4,5-二氟苯甲酸以及牛胰腺胰 島素標準品均購自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。 樣品 用 50/50 的水/乙腈配制濃度為 1 mg/mL 的氯二氟苯甲酸儲備液。用 這些儲備液配制不同濃度比的三種化 合物的混合物。 pH 為 2.55 時，將濃度為 1 mg/mL 的胰島素溶于 25 mmol/L 的磷酸鈉緩 沖液中。為使胰島素脫酰胺基化，將 胰島素溶液的 pH 值調(diào)為 9，并在室 溫下放置 12 個小時。

……

結論 本應用簡報展示了使用高分辨率采 樣二維液相色譜對樣品中與主要化 合物具有相似結構的低濃度雜質(zhì)的 檢測。根據(jù) ICH 指南對新原料藥中 雜質(zhì)的相關規(guī)定，使用氯二氟苯甲 酸的混合物進行測試，結果顯示相 對濃度為 0.05%、0.10%、0.15% 和 100% 且在第一維分析中無法單 獨檢測到的化合物，可通過高分辨 率采樣二維液相色譜轉(zhuǎn)移至第二 維色譜柱并進行分離。檢測到的化 合物 5-氯-2,4 二氟苯甲酸的準確度 值為 71.6–108.5%。峰面積精度為 2.71–7.95%。以 Agilent 1290 Infinity II HDR-DAD 雜質(zhì)分析儀解決方案作為 第二維檢測器可以增加進樣量，同時 可以改善準確度 (96.4–108.5%) 和峰面 積精度 (1.44–1.58%)。以脫酰胺胰島 素作為實際樣品，使用高分辨率采樣 2D-LC/MS 進行分析。使用 Agilent MassHunter 的第二維色譜圖生成器 評估數(shù)據(jù)。在兩次切割中通過對應的 同位素模式檢測并鑒定了胰島素的單 一脫酰胺產(chǎn)物，兩次切割均在第一維 胰島素主峰拖尾處進行采集。