摘要：本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)建立了 氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和琥珀氯霉素的分析方法。動物源性樣品（肌肉、 內(nèi)臟、蜂產(chǎn)品、水產(chǎn)品、乳制品等）經(jīng)過提取后，采用薄殼型填料反相 C18 色譜 柱 — Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離，經(jīng)配有安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧 離子源的安捷倫三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)在負離子模式下監(jiān)測。該方法氯霉素在 0.1-10 ng/mL 和其他化合物在 1-100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性相關性良好，相關系數(shù) R2 ≥ 0.998；在 0.1 µg/kg（氯霉素）和 1 µg/kg（其他化合物）添加濃度下，各化合 物峰面積 RSD 在 1.6%-5.7% 之間；定量下限氯霉素達到 0.05 µg/kg，其他化合物達 到 0.5 µg/kg。通過對方法靈敏度、精密度和線性范圍等方法學參數(shù)進行考察， 得到所建立的方法能在 10 min 內(nèi)對 4 種氯霉素類藥物完成快速、高靈敏度的檢 測分析，同時采用同位素內(nèi)標法進行定量測定，*法規(guī)監(jiān)測要求。

前言：氯霉素 (Chloramphenicol, CAP) 是一種人工合成的廣譜抗生素，能引起人的再生障 礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥、新生兒灰色綜合癥等疾病，尤其是氯霉素的低 濃度藥物殘留會誘發(fā)致病菌的耐藥性。氯霉素的殘留不但對人體造成危害，而 且嚴重影響我國動物性食品的出口。2003 年歐盟規(guī)定牛奶、肉、蛋、水產(chǎn)品、 蜂蜜等食品中氯霉素殘留檢測的極限值 (MRPL) 為 0.3 µg/kg。氯霉素類藥物的檢測方法目前有 GC/MS 法、LC/MS 法和 酶聯(lián)免疫法等。近年來，隨著液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和相關技術的 快速普及以及對此類禁用藥物越來越苛刻的檢測限要求， 液質(zhì)聯(lián)用儀技術因其靈敏度高、無需衍生化等特點，已成為動 物源性食品中氯霉素類藥物殘留量的主要檢測確證技術手 段[12-13]，被廣泛應用于監(jiān)督監(jiān)管。目前國內(nèi)檢測氯霉素類 藥物的主要參照標準包括：《GB/T 20756-2006 可食動物肌 肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量 的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、《農(nóng)業(yè)部 781 號公告-2-2006 動物源食品中氯霉素殘留量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜法》和《SN/T 1864-2007 進出口動物源食品中氯霉素殘 留量的檢測方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》等[1-11]。由于氯霉 素類藥物屬于禁用類藥物，其檢出為“零允許量"(Zero tolerance)，考慮到 液質(zhì)聯(lián)用儀檢測靈敏度能力，氯霉素檢測限為 0.05 µg/kg。 針對此類禁用性藥物的嚴格及苛刻的監(jiān)測需求，本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用 系統(tǒng)建立了快速檢測 4 種氯霉素類藥物的確證定量方法。 該方法可以滿足動物肌肉、內(nèi)臟、水產(chǎn)品、蜂產(chǎn)品、乳制 品、飼料等動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量的監(jiān)測。

實驗部分 試劑、化學品與消耗品 所有試劑和化學品均為色譜純級或者分析純級。甲醇、乙 腈、正己烷和乙酸乙酯購自德國默克 (MERCK)。所用實驗 用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水。 氯霉素類藥物標準品及同位素內(nèi)標 (D5-Cap) 購自德國奧格 斯堡 (Dr. Ehrenstorfer)。所有標準品用甲醇配制為 1 mg/mL 儲備液，儲存在 -20 °C 冰箱內(nèi)（有效期 1 年左右）。用乙 腈:水 (50:50) 配制混合工作液，儲存在 4 °C 下（有效期 1 個 月左右）。 實驗采用 Agilent Bond Elut C18 固相萃取柱對樣品提取液進 行凈化。

儀器配置 實驗采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)進行分離，其由 下列部件組成： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 標準自動進樣器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 自動進樣器冷卻器 (G1330B） • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) 采用配有安捷倫噴射流 (AJS) 電噴霧離子源的 Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，在正離子模式下進行檢測。 采用 Agilent MassHunter 工作站軟件（B.07 或以上版本）進 行數(shù)據(jù)采集、定性和定量分析。 樣品前處理 稱取 2 g 均質(zhì)后的樣品（精確至 0.1 g）于 50 mL 聚四氟乙烯 離心管中，用 15 mL 乙酸乙酯分兩次提取，振蕩 30 min， 4000 轉(zhuǎn)/min 離心 2 min，合并提取液，于 40 °C 水浴旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)近干。殘余物用 20 mL 4% 氯化鈉溶液轉(zhuǎn)移至離心管中， 分兩次每次加入 10 mL 正己烷進行液-液分配去脂肪。水相 用 15 mL 乙酸乙酯分兩次提取，合并提取液，于 40 °C 水浴 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。Bond Elut C18 固相萃取柱依次用 3 ml 甲醇 和 3 mL 水活化，用 5 mL 10% 甲醇水溶液溶解殘渣全部轉(zhuǎn) 移至固相萃取柱，用 5 mL 甲醇洗脫，收集濾液，氮氣下吹 干，殘留物用 1 mL 流動相溶解，過濾膜或高速離心后上機 測定。

結(jié)果與討論 本文采用含有薄殼型填料顆粒的 Poroshell 120 EC-C18 色譜 柱對氯霉素類藥物進行了有效的色譜分離，此填料 (2.7 µm) 和規(guī)格 (3.0 x 100 mm) 的色譜柱具有較高的分離柱效和柱載 量，同時具有較低的色譜壓力，非常適合分析動物源樣品 基質(zhì)中的藥物殘留。采用 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分析 氯霉素類藥物混合工作液所得 MRM 色譜圖如圖 1 所示。

在雞肉基質(zhì)提取液中添加混合工作液，從而獲得氯霉素 0.1 µg/kg 和其他化合物 1µg/kg 的基質(zhì)加標樣品，連續(xù)進樣 10 針測試穩(wěn)定性。如圖 3 所示，4 種化合物在基質(zhì)低濃度添 加下峰面積 RSD 在 1.6%-5.7% 之間，*測試的穩(wěn)定性 要求。

由于采用負離子模式分析氯霉素類藥物，所以流動相系統(tǒng) 中應避免酸對靈敏度的影響。本方法適用于肌肉組織、內(nèi) 臟、蜂產(chǎn)品、水產(chǎn)品、乳制品、飼料等樣品中氯霉素類藥 物的測試分析。注意對于不同基質(zhì)類型樣本的處理方法有 所區(qū)別，可參考標準方法進行樣本的前處理。

結(jié)論 本文所述方法采用 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6495 三重四 極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對動物源性食品中氯霉素類 禁用藥物殘留量的高靈敏、快速地確證定量分析。本方法 以國內(nèi)發(fā)布的檢測標準為依據(jù)，方法學各項參數(shù)* 或高于國家標準的檢測要求，并可應用于各類動物源性樣 品基質(zhì)中氯霉素類藥物殘留的快速檢測。