摘要：本應(yīng)用簡報介紹了一種簡便而快速的方法，其采用經(jīng)改良的光電倍增管 (PMT) 的熒光檢 測器 (FLD) 來分析特級初榨橄欖油 (EVOO) 中葉綠素?zé)峤到猱a(chǎn)物脫鎂葉綠素 (PP) 和原焦 脫鎂葉綠素 (PPP)。采用 Hamamatsu R928HA 紅敏 PMT 代替標(biāo)準(zhǔn) PMT，可以將原始信 號提高約 120 倍。另外，由于基線噪音的降低，總體分析性能提高了 180 倍。本方法對 稀釋的 EVOO 直接進行分析，無需進行其他的樣品前處理，與傳統(tǒng)國際標(biāo)準(zhǔn)組織 (ISO) 的 固相萃取 (SPE)/紫外檢測 (UV) 方法相比，該方法不僅降低溶劑消耗量和縮短液相色譜循 環(huán)時間，分離度也得到了提高。

前言 EVOO 是采用機械方法從橄欖 (Olea europaea L.) 中獲得的。葉綠 素是存在于 EVOO 中的天然綠色色素，已證明其在加工和儲存過 程中易于降解為脫鎂葉綠素和原焦脫鎂葉綠素。在果實研磨和打 漿過程中，葉綠素受酸性條件和加熱的影響尤為明顯，各成分的密 切接觸，往往會釋放出酸性化合物，導(dǎo)致大幅度的葉綠素脫鎂反 應(yīng) [1]。因此可使用葉綠素降解產(chǎn)物作為 EVOO 的一個質(zhì)量參數(shù)。 ISO 的 PPP 分析方法作為橄欖油標(biāo)準(zhǔn)的一部分，于 2010 年被澳 大利亞和新西蘭采用，而其他國家尚待采用。根據(jù)所獲得的數(shù)值 可確定 EVOO 的保存是否得當(dāng)，或者 EVOO 是否摻雜了精煉橄 欖油。 ISO 29841 中的傳統(tǒng) SPE/UV 方法包括幾個樣品前處理步驟，這 些步驟會耗費大量的溶劑和時間。在改良的 FLD 方法中，采用異 丙醇稀釋橄欖油樣品后即可進行 HPLC 進樣分析。采用四元溶 劑梯度方法，通過四元梯度泵進行第四種強溶劑（四氫呋喃）沖 洗，不需要對任何溶劑進行預(yù)混合，而且還大大減少了前次分析 在色譜柱上殘留的橄欖油。此外，采用在紅光區(qū)更敏感的 PMT 代 替標(biāo)準(zhǔn) PMT，使 FLD 靈敏度提高了 180 倍。

實驗部分 儀器配置 ISO 29841 SPE/UV 方法 Agilent 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)，由化學(xué)工作站（版本 C.01.03 [44]）控制，含以下模塊：二極管陣列檢測器 (DAD) 作為 原始 ISO 方法的 UV 檢測器。 • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 自動進樣器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) • Agilent 1290 Infinity 二極管陣列檢測器 (G4212A) 改良的 FLD 方法 Agilent 1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)，由化學(xué)工作站（版本 C.01.03 [44]）控制，含以下模塊： • Agilent 1260 Infinity 四元泵 (G4204A) • Agilent 1290 Infinity 自動進樣器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C) • Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器 (G1321B)，配置 Hamamatsu R928HA PMT

樣品前處理 所有溶劑均為液相色譜級（與液相色譜條件中相同）。新制 Milli-Q 水來自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)。 ISO SPE/UV 方法 將約 300 mg 橄欖油樣品溶解在 1 mL 石油醚中，充分渦旋混合。 將樣品溶液注入 1000 mg/6 mL 硅膠小柱（Phenomenex，美國 加利福尼亞州托倫斯）上，用每份 1 mL的石油醚淋洗兩次。一旦 溶劑在柱填料頂部排干，用 5 mL的石油醚/乙mi（90:10，v/v） 洗脫非極性物質(zhì)兩次，并棄去。然后，用 5 mL丙酮洗脫脫氧葉綠素 組分，將其收集到一支 10 mL 玻璃試管中，用錫箔蓋封（避光）。 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在最高 20 °C 下蒸干溶劑，再用 1 mL 丙酮復(fù)溶，以 進行下一步 HPLC 分析 [2]。

良的 FLD 方法 取 200 mg 的橄欖油樣品溶解在 1 mL 異丙醇溶劑中，渦旋混合 15 秒。

結(jié)果與討論 圖 1 顯示了兩種 ISO 樣品前處理和檢測方案得到的疊加色譜圖， 這兩種樣品前處理和檢測圖解分別為 SPE/UV（藍(lán)色）和稀釋/FLD （紅色），并使用針對稀釋/FLD 新開發(fā)的改良色譜條件。兩種方法 得到的 PPP 值均為 15%（根據(jù)公式 1 計算）。兩種樣品前處理方 法都顯示出了良好的 HPLC 分離度，脫氧葉綠素 a 和脫氧葉綠素 a’ 的分離度比 ISO 法色譜條件有了明顯改善。

SO SPE/UV 方法的樣品前處理時間為 30 分鐘，HPLC 分析時間 為 40 分鐘或更長。而采用改良后的 UHPLC/FLD 方法，配置 3.0 × 100 mm C18 柱的四元系統(tǒng)，稀釋步驟非常短暫，分析時間縮短 到 25 分鐘。與標(biāo)準(zhǔn) ISO 條件相比，UHPLC 分析的溶劑消耗量和 總分析時間只有原來的 40% 或更少。這表明分析成本和時間顯著 減少，而且還提高了低含量樣品的靈敏度。 % PPP = 100 × Appp/(App + Appp) 其中， % PPP = % 橄欖油樣品中原焦脫鎂葉綠素的 % 含量 Appp = 原焦脫鎂葉綠素 a 的峰面積 App = 脫鎂葉綠素 a 和脫鎂葉綠素 a’ 的總峰面積 公式 1. 橄欖油中 PPP 含量的計算

結(jié)論 實驗證明，與傳統(tǒng)的 ISO SPE/UV 方法相比，改良的 FLD 方法是 一種更有前景的選擇。在本實驗中，用 R928HA 紅敏光電倍增管 取代標(biāo)準(zhǔn) PMT 后，可以檢測低含量的 PPP 樣品。從而在時間、 人力、SPE 材料和溶劑消耗量等方面，為那些極多樣品分析的實 驗室節(jié)省了大量的成本。