摘要：本實(shí)驗(yàn)以 Agilent 5975 系列 GC/MSD 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，使用選擇性離子監(jiān)測 (SIM)/SCAN數(shù)據(jù)同步采集檢測模式測定葡萄酒中的 61 種揮發(fā)性化合物，開發(fā)出一種半定量的自動(dòng)化頂空固相微萃取 (HS-SPME) 氣相色譜/質(zhì)譜 (GC/MS) 方法。通過此方法對(duì)美國市售的24 種赤霞珠干紅葡萄酒和混釀葡萄酒進(jìn)行了分析。將葡萄酒分析結(jié)果與描述性的感官評(píng)定相對(duì)比，開發(fā)一種快速的靶向分析方法，使其能夠?qū)σ恍┓枷阈愿泄偬匦赃M(jìn)行預(yù)測。此項(xiàng)工作可幫助美國葡萄酒行業(yè)定義現(xiàn)有的赤霞珠葡萄酒風(fēng)格，并確定需要進(jìn)一步市場開發(fā)的區(qū)域。

前言目前，人們對(duì)于采用化學(xué)分析方法研究葡萄酒感官特性的做法越來越感興趣。飛行時(shí)間 (TOF) 質(zhì)譜聯(lián)用綜合型氣相色譜后，可分析成千上萬種化合物。但是，并非所有的化合物都會(huì)對(duì)葡萄酒的感官特性產(chǎn)生必然影響，還需進(jìn)行強(qiáng)大而復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)分析，將這些復(fù)雜的化學(xué)組分與表現(xiàn)出的感官特性聯(lián)系起來。對(duì)特定化合物的靶向分析可以為評(píng)估葡萄酒中各種揮發(fā)性化合物提供一種快速的替代方法，將這些化合物與感官描述語相關(guān)聯(lián)。在單四極桿質(zhì)量選擇檢測器 (MSD) 上采用 SIM/SCAN 數(shù)據(jù)同步采集不僅可以快速獲得用于分析物確證的全掃描譜圖，還可對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行高靈敏度、高選擇性的定量和檢測。本應(yīng)用簡報(bào)將介紹一項(xiàng)已發(fā)表的研究，該研究使用 HS-SPME 和5975 系列 GC/MSD 系統(tǒng)成功開發(fā)出一種針對(duì)美國赤霞珠葡萄酒和混釀葡萄酒的分析方法，可以對(duì)葡萄酒的多項(xiàng)重要感官描述語進(jìn)行預(yù)測 [1]。以前曾有報(bào)道將 SIM/SCAN 數(shù)據(jù)同步采集用于分析葡萄酒的揮發(fā)物 [2,3]，但將 SIM/SCAN 數(shù)據(jù)同步采集用于鑒定可能使葡萄酒產(chǎn)生芳香氣味的揮發(fā)性化合物，這還是第一次。實(shí)驗(yàn)最終從不同葡萄酒中一共鑒定出 55 種截然不同的揮發(fā)性有機(jī)物。統(tǒng)計(jì)分析將這些化合物與 7 種香氣和 12 種味道和口感特性進(jìn)行關(guān)聯(lián)，不同葡萄酒所得分析結(jié)果也截然不同。

實(shí)驗(yàn)部分葡萄酒研究所用的全部葡萄酒均購買自市場，且產(chǎn)自美國本土。研究共采用 24 種赤霞珠干紅葡萄酒和混釀葡萄酒（至少含有 56% 的赤霞珠），其中 19 種來自加州，5 種來自華盛頓。標(biāo)樣根據(jù)以前的報(bào)道 [4,5]，本研究共涵蓋 61 種目標(biāo)化合物。這些化合物中，有 58 種由參比化合物分析進(jìn)行確證，見之前的文獻(xiàn)報(bào)道[1]。將被測化合物的保留時(shí)間和譜圖與認(rèn)證標(biāo)樣進(jìn)行匹配。儀器此分析方法采用 Agilent 5975 系列 GC/MSD 系統(tǒng)聯(lián)用 Agilent6890 GC（配置有 Gerstel MPS2 自動(dòng)進(jìn)樣器）開發(fā)而得。氣相色譜和質(zhì)譜的運(yùn)行條件見表 1。SIM 參數(shù)中所用的離子和每個(gè)化合物的保留時(shí)間可參見上文所述的已出版研究文獻(xiàn) [1]。實(shí)驗(yàn)還使用與文獻(xiàn)相同的氣相色譜、色譜柱和自動(dòng)進(jìn)樣器（聯(lián)用 Agilent7000B 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)）對(duì) 2-異丁基-3-甲氧基吡嗪(MIBP) 進(jìn)行了分析 [1]。樣品前處理將葡萄酒樣品（10 mL，未經(jīng)稀釋）移取到 20 mL 圓底棕色玻璃頂空瓶中，每個(gè)頂空瓶中裝有 3 g (± 0.02) NaCl。迅速將頂空樣品瓶放入儀器，進(jìn)行分析。使用 2 cm 二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲硅氧烷（DVB/CAR/PDMS，Supelco），23號(hào) SPME 纖維頭進(jìn)行采樣。將樣品置于 30 °C 條件下溫?zé)?，?500 rpm 的速度攪拌 5 min，再插入纖維頭，在 30 °C 下以 250 rpm 的速度攪拌30 min。所有樣品平行 3 份按隨機(jī)的順序，載入儀器后在 18 個(gè)小時(shí)內(nèi)完成分析。

感官評(píng)定所有葡萄酒都按隨機(jī)均衡的原則排列，每種一式三份，接受 11 位經(jīng)過事先篩選和培訓(xùn)（如文獻(xiàn)所述 [1]）的感官評(píng)審員的評(píng)審。最終，評(píng)估了 20 種香氣特性和 14 種味道和口感特性。每種特性的程度由一條以“低"和“高"進(jìn)行標(biāo)記的 15 cm 的非結(jié)構(gòu)化直線標(biāo)度進(jìn)行評(píng)估，少數(shù)特性除外，這部分特性采用其他相反的形容詞對(duì)進(jìn)行描述。

數(shù)據(jù)分析對(duì)于半定量靶性分析方法，采用相對(duì)于內(nèi)標(biāo)物（2-十一酮）的提取離子峰面積對(duì)色譜峰進(jìn)行定量。使用 GC/MS/MS 測定 MIBP時(shí)，實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線，由 MIBP 相對(duì)于內(nèi)標(biāo)物 (2H3MIBP) 的相對(duì)響應(yīng)計(jì)算 MIBP 的絕對(duì)濃度。

本實(shí)驗(yàn)采用方差分析法 (ANOVA) 對(duì)化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過偽混合模型測試確定葡萄酒和重復(fù)數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，以均方差（葡萄酒*重復(fù)數(shù)）作為誤差。對(duì)于感官描述語分析，實(shí)驗(yàn)采用偽混合模型測試對(duì)葡萄酒、重復(fù)數(shù)以及評(píng)審員的影響進(jìn)行雙因素方差分析，以包含葡萄酒的交互作用項(xiàng)的均方差作為誤差。通過多個(gè)兩兩相關(guān)分析和偏最小二乘回歸 (PLSR) 分析建立化學(xué)性質(zhì)與感官數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，通過 PLS2 將化學(xué)數(shù)據(jù)設(shè)為 x 變量（預(yù)測變量），感官描述數(shù)據(jù)設(shè)為 y 變量 [1]。使用單個(gè)的感官特性（y 變量）和化學(xué)數(shù)據(jù)（x 變量）進(jìn)一步生成 PLS1 模型系列。

?結(jié)果與討論關(guān)聯(lián)化學(xué)和感官數(shù)據(jù)采用偏最小二乘回歸法 (PLSR) 對(duì)研究中涉及的 24 種赤霞珠葡萄酒和混釀葡萄酒的標(biāo)準(zhǔn)化重要化學(xué)和感官數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 [1]，結(jié)果見圖 1。前兩個(gè)主成分 (PC) 對(duì)化學(xué)數(shù)據(jù)（x 變量）和感官數(shù)據(jù)（y 變量）的貢獻(xiàn)分別占 38% 和 46%。第三個(gè)主成分對(duì)化學(xué)和感官數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)分別為 7% 和 10%（數(shù)據(jù)未示出）。本模型通過改良型氣相色譜方法對(duì)赤霞珠葡萄酒和混釀葡萄酒中的 56 種化合物進(jìn)行了測定，其中有 36 種對(duì)感官特性 (PLS2) 有顯著 (p < 0.05) 影響，如這些化合物在圖 1A 中相對(duì)于曲線的位置所示。為了更深層地探索化合物與感官特性之間的關(guān)系，我們對(duì)每個(gè)感官特性又進(jìn)行了 PLS1 回歸分析。化學(xué)組分與香氣所測得的揮發(fā)性化合物可能會(huì)與很多感官描述語有關(guān)例如，二乙酰和乙偶姻均會(huì)產(chǎn)生奶油糖果的香氣（圖 1A）。這兩種化合物會(huì)使食品和葡萄酒具有黃油的味道。已知化合物 4-乙基苯酚與 4-乙基愈創(chuàng)木酚會(huì)使葡萄酒產(chǎn)生類似于皮革或馬鞍的味道，它們與本研究涉及的 a-柏木烯一起，會(huì)釋放出稗草的氣味（圖 1A）。2-異丁基-3-甲氧基吡嗪 (MIBP) 具有柿子椒的氣味，與植物香氣呈正相關(guān)。PLS2 分析顯示（圖 1A），多種酯類（如，乙酸己酯和 2-苯基乙酸乙酯）、萜烯類（如，芳樟醇和 b-香茅醇）以及降異戊二烯化合物（如，b-突厥烯酮和 a-紫羅蘭酮）均和漿果及鮮果香氣有關(guān)。

化合物與味道和口感相關(guān)本研究發(fā)現(xiàn)大量的揮發(fā)性化合物與味道和口感相關(guān)（圖 1，表 3），但這只代表它們之間存在相關(guān)性而非因果關(guān)系。計(jì)分圖（圖 1B）中的赤霞珠干紅葡萄酒和混釀葡萄酒采用代碼按所測酒精濃度從低 (W1 = 12.4% v/v) 到最高 (W24 = 15.9% v/v) 的順序進(jìn)行標(biāo)識(shí)。模型中葡萄酒的主要差異為酒精濃度的不同（圖 1B），這說明酒精濃度可能會(huì)間接地區(qū)分載荷圖中的化合物和感官特性（圖 1A）。因此，模型中有大量重要的化合物會(huì)對(duì)味道和口感產(chǎn)生影響，如在高度數(shù)酒中濃度較高的酯類，高級(jí)醇類，單萜類，降異戊二烯類，內(nèi)酯類和酚類，與之相關(guān)的感官特性在高度數(shù)酒中也較突出，如苦味，澀味，粘度，辛辣度，粗糙和燒灼感。酒精度的重要性酒精濃度較低的葡萄酒（以較低的代碼表示）位于圖 1B 中的左側(cè)，而酒精濃度較高的葡萄酒則位于圖右側(cè)。PC1 圖中左側(cè)為氣味更偏重于果香和口感更甜的葡萄酒樣品，相比之下，右側(cè)則為酒味更濃，口感更苦澀的葡萄酒樣品（圖 1A）。低度葡萄酒 W1-7(12.4–13.8% v/v) 通常味道更甜，果香和奶香更濃，口感更絲滑。相反，圖右側(cè)的高度數(shù)葡萄酒 W8-24 (13.9–15.9% v/v)（圖 2）通常更苦澀，木香味更重，整體氣味更濃烈，酒精味重，并伴有辛辣，粗糙和燒灼感。位于圖中右下象限的一組葡萄酒，包括W9、W12-13、W16-22 和 W24，密集成一簇，說明這些葡萄酒具有相似的化學(xué)和感官特性，盡管酒精濃度范圍為 14.3–15.9% v/v。

其他感官特性還有一些感官特性不能很好地通過 PLSR 建模關(guān)聯(lián)，可能是由于目前開發(fā)的氣相色譜方法未能檢測到相關(guān)的化合物，其中有一類含硫揮發(fā)性化合物就沒有被檢出。由于它們具有易揮發(fā)性，因此分析這些化合物往往需要特定的氣相色譜柱和/或特定的檢測器 [1]。有研究表明這些化合物影響著赤霞珠葡萄酒的品種特性。將來的工作包括擴(kuò)大和調(diào)整 HS-SPME/GC/MS 方法的分析范圍，將其他已知影響葡萄酒感官特性的重要揮發(fā)性化合物都包括在內(nèi)。相反地，研究還發(fā)現(xiàn)，許多檢出的化合物對(duì)葡萄酒沒有任何感官的重要影響。這可能是因?yàn)槠浜康陀诟泄匍撝?，或者其在葡萄酒產(chǎn)生的感官特性無法被清晰準(zhǔn)確地描述出來；也可能是混合作用的結(jié)果，揮發(fā)物之間的協(xié)同或者掩蔽作用使個(gè)體化合物的感官效應(yīng)難以顯現(xiàn)。

結(jié)論本研究開發(fā)了一種測定葡萄酒中大量揮發(fā)性化合物的靶向快速分析方法。此方法可以對(duì)一系列重要的感官描述語進(jìn)行預(yù)測，無需繁瑣的樣品前處理或者使用更加昂貴的儀器（即，多維 GC或者 TOF MS）。該方法使用 HS-SPME/GC/MS 技術(shù)，采用SIM/SCAN 數(shù)據(jù)同步采集檢測法，在優(yōu)化靈敏度的同時(shí)有效提高了目標(biāo)分析物的選擇性。本研究通過此方法，發(fā)現(xiàn)美國市售的赤霞珠干紅葡萄酒和混釀葡萄酒在化學(xué)性質(zhì)和感官屬性上存在差異，部分原因是由于酒精含量不同造成了直接和間接的影響。