摘要本研究建立了一種高靈敏度、高特異性的分析方法，用于定量分析一組環(huán)孢素 A (CsA)、依維莫司 (Eve)、西羅莫司 (Sir) 以及他克莫司 (Tac)。該方法運(yùn)行時(shí)間為 2 分鐘，適于同時(shí)定量分析全血中的所有四種分析物。

 

前言本應(yīng)用簡報(bào)介紹了一種采用 Agilent 1260 液相色譜系統(tǒng)結(jié)合配置了安捷倫噴射流技術(shù)的Agilent 6460 三重四極桿質(zhì)譜儀，靈敏而準(zhǔn)確地檢測全血中四種免疫抑制藥物，環(huán)孢素A (CsA)、依維莫司 (Eve)、西羅莫司 (Sir) 以及他克莫司 (Tac) 的分析方法。采用串聯(lián)質(zhì)譜儀 (MS/MS) 和多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 技術(shù)，該方法中 CsA 的線性范圍為 1.95 ng/mL 到2000 ng/mL，Eve、Sir 和 Tac 的線性范圍為0.10 ng/mL 到 100 ng/mL。

 

實(shí)驗(yàn)部分試劑和標(biāo)樣為開發(fā)分析方法，除環(huán)孢素 A-d4 和未標(biāo)記的依維莫司分別購于多倫多研究化學(xué)品公司和 Sigma-Aldrich 公司外，所有未標(biāo)記和標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品均購于 Cerilliant 公司。所有標(biāo)準(zhǔn)品均保存在 -20 °C 環(huán)境下。使用氘代模擬內(nèi)標(biāo)物 (ISTD) 以確保準(zhǔn)確定量。分析物及其對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物在表 1 中列出。所有其他LC/MS 級(jí)溶劑和試劑均購于 Sigma-Aldrich和 Honeywell 公司。經(jīng)認(rèn)證的健康全血購于當(dāng)?shù)氐囊患已獛?。此外，使用了來?ChromSystems 的校準(zhǔn)品和來自 BioRad 的質(zhì)控品 (QC)，以評(píng)估該方法的準(zhǔn)確度和精密度（表 9）。為測定線性度，將標(biāo)準(zhǔn)品加入全血中得到高濃度校準(zhǔn)標(biāo)樣，CsA 為 2000 ng/mL，Eve、Sir 和 Tac 每種為 100 ng/mL。然后用全血進(jìn)行兩倍連續(xù)稀釋，以獲取剩余標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。線性分析中用到的分析物濃度在表 2 中列出。

 

樣品前處理所有校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品都采用一種簡單的蛋白沉淀程序進(jìn)行前處理：1. 將 100 µL 的全血與 200 µL 含有內(nèi)標(biāo)的沉淀試劑（0.4 M 硫酸鋅:甲醇為 1:4）混合2. 渦旋 30 s3. 以 10000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 4 分鐘4. 將上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，并使用 LC/MS/MS 分析液相色譜配置和條件使用 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。該系統(tǒng)包括：• Agilent 1260 Infinity 二元泵 (×2)• 帶 2 位/6 通色譜柱切換閥的 Agilent1260 Infinity 柱溫箱• Agient 1260 恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器為提高儀器的穩(wěn)定性，也推薦在自動(dòng)進(jìn)樣器針座和進(jìn)樣閥之間使用在線過濾器（部件號(hào)5067-1551）。液相色譜條件在表 3、4、5 和表 6 中列出。

自動(dòng)化在線樣品凈化本方法所用的 HPLC 采用兩個(gè)二元泵以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣品凈化（圖 2）。樣品上樣到捕集柱，分析物保留在柱內(nèi)，然后使用第一個(gè)泵進(jìn)行了沖洗。沖洗液流入廢液容器，減少了進(jìn)入質(zhì)譜儀的基質(zhì)量。在分析物即將從捕集柱中洗脫時(shí)切換閥頭，使洗脫的分析物進(jìn)入分析柱，然后通過第二個(gè)二元泵進(jìn)行進(jìn)一步色譜分離。

 

質(zhì)譜條件采用使用了噴射流技術(shù)的 Agilent 6460 三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行分析。*的 MRM 轉(zhuǎn)換離子對(duì)保證了對(duì)每種分析物定量分析的特異性。內(nèi)標(biāo)物 (ISTD) 的使用減少了因樣品前處理過程中分析物損失或者因樣品基質(zhì)差異而造成的誤差。質(zhì)譜條件和 MRM 轉(zhuǎn)換離子對(duì)在表 7 和表 8 中列出。

 

使用市售校準(zhǔn)品 (ChromSystems) 和質(zhì)控品(BioRad) 進(jìn)行了日間進(jìn)樣以評(píng)估該方法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)由 4 名不同的操作人員在 14 天的時(shí)間內(nèi)取得。每個(gè)濃度質(zhì)控品的實(shí)測準(zhǔn)確度在表 9 中列出。

結(jié)論本研究使用 Agilent 6460 三重四極桿LC/MS/MS 系統(tǒng)開發(fā)了一種高通量、運(yùn)行時(shí)間為 2 分鐘的分析方法，用于免疫抑制劑環(huán)孢素 A、依維莫司、西羅莫司以及他克莫司的定量分析。經(jīng)過簡單的蛋白沉淀后，進(jìn)行自動(dòng)化在線樣品凈化，最大限度地減少了血液中生物化合物造成的基質(zhì)效應(yīng)和離子抑制。采用這種方法實(shí)現(xiàn)了全血基質(zhì)中所有四種分析物可靠且快速的定量分析。所有分析物經(jīng)證實(shí)在所需的范圍內(nèi)都具有良好的線性。