摘要：本實驗采用穩(wěn)定同位素稀釋法 (SID) 和多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜法 (MRM-MS) 開發(fā)了一個用于同時測定血清中載脂蛋白 A-I 和 B 的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 方法。方法聯(lián)用Agilent 1290 Infinity LC 和 Agilent 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)。采用如下樣品處理過程進行血清消化：向 0.5 µL 血清中加入 6 mol/L 尿素使蛋白變性，再加入 1 µg 胰蛋白酶生成多個載脂蛋白 A-I 和 B 的特征肽。在正常和高甘油三酯血癥血清中，都可以準(zhǔn)確測出這些特征肽。實驗采用確定濃度、基質(zhì)匹配的混合血清樣品直接進行校準(zhǔn)。載脂蛋白 A-I 多肽的運行間不精密度小于 8.6%，載脂蛋白 B 多肽的運行間不精密度小于 6.4%?？傊捎脦Funnel 技術(shù)的 Agilent 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)，只需很少量的樣品即可同時對血清載脂蛋白 A-I 和 B 進行準(zhǔn)確的定量分析。

前言心血管臨床研究中一個常見的主題就是血清膽gu醇、高密度和低密度脂蛋白膽gu醇（HDLc 和 LDLc）的測定。由于高密度脂蛋白 (HDL) 和低密度脂蛋白 (LDL) 顆粒存在異質(zhì)性，因此 HDLc 和 LDLc 測定的方法很難實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。由于高甘油三酯血癥樣品產(chǎn)生的干擾，這些分析的結(jié)果也時常不準(zhǔn)確。實際存在一種潛在的替代型 HDLc 和 LDLc 測定方法，即測定與其相應(yīng)的載脂蛋白。載脂蛋白 (Apo) A-I 和 B 是 HDL 和 LDL 顆粒最重要的蛋白，Apo B/Apo A-I 的比率對于臨床研究非常有價值1。本應(yīng)用簡報將探討采用 LC/MS/MS 實現(xiàn)血清 Apo A-I 和 B 的多成分定量分析。

通過聯(lián)用液相色譜與質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 測定胰dan白酶消化所得特征肽，可實現(xiàn)載脂蛋白高靈敏度、高選擇性的直接定量分析2–5。此外，LC-MS/MS 的高特異性可以防止在血脂異常血清中發(fā)生與其他類型分析一樣的干擾。實驗采用 Agilent 1290 Infinity LC 系統(tǒng)和帶iFunnel 技術(shù)的 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)，開發(fā)了用于 Apo A-I 和 B 定量的 LC-MS/MS分析方法。此方法僅使用少量樣品 (0.5 µL)，即可分析來自 Apo A-I 和 B 以及潛在其他載脂蛋白的多種特征肽。

實驗部分樣品制備采用 pH 8 的 50 mmol/L 碳酸氫銨 (ABC) 溶液將人血清樣品稀釋 28 倍 (5 µL + 135 µL)。采用 6 mol/L 尿素溶液將載脂蛋白從脂蛋白顆粒中溶出并使之變性。采用 9.1 mmol/L二硫蘇糖醇 (DTT) 溶液還原二硫鍵，并采用21.5 mmol/L 碘乙酰胺 (IAA) 溶液進行烷基化。在添加 ABC 稀釋尿素溶液至終濃度0.76 mol/L 后，使用 1 µg 測序級胰dan白酶（普洛麥格公司）對每個樣品進行消化（表 1）。

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胰dan白酶將載脂蛋白從精an酸 (R) 和賴氨酸(K) 處裂解，生成選擇用于 Apo A-I 和 B 檢測的特征肽（表 2）。向每個樣品中加入已知濃度、由穩(wěn)定同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn) (SIS) 肽（由我們自已合成），以校正樣品檢測中的任何損失。按照 CLSI C37-A 配制三種確定濃度、基于血清的校準(zhǔn)樣品，用于血清中 ApoA-I 和 Apo B 的直接定量分析。校準(zhǔn)樣品可溯源到 WHO-IFCC 標(biāo)準(zhǔn)。目標(biāo)值為：Apo A-I的濃度為 1.15 g/L、1.60 g/L 和 1.60 g/L（濃度 2 和濃度 3 相同），Apo B 的濃度為 0.76 g/L、0.80 g/L 和 1.29 g/L。

數(shù)據(jù)采集色譜分離在 Agilent 1290 Infinity 液相色譜(UHPLC) 系統(tǒng)上進行，采用一個 15 min 的梯度程序（5% - 95% (v/v) 甲醇/水 + 0.05%(v/v) 甲酸），色譜柱為 ZORBAX StableBond C18 色譜柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 µm)，流速 0.2 mL/min。采用 Agilent 6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)進行檢測。我們建立了一個動態(tài) MRM (dMRM) 方法，用于檢測所選特征肽保留時間范圍內(nèi)特定的母離子和子離子（定量離子和定性離子）。除特定的MRM 離子對外，定量和定性子離子的保留時間及其比值也被用來確保這些特征肽的特異性檢測。此外，還使用了觸發(fā)式 MRM(tMRM) 檢測額外的子離子，用于同合成標(biāo)準(zhǔn)肽的數(shù)據(jù)庫譜圖進行比較，比較結(jié)果以匹配分值 (MS) 表示（表 2）。特征肽從相關(guān)文獻2–5 和 Peptide Atlas BestSRM 離子對列表中選出。實驗通過測定相對于 SIS 肽的內(nèi)源性肽含量并采用基于血清的校準(zhǔn)樣品，利用來自 Apo A-I 和 B 的四種不同特征肽對血清中的 Apo A-I 和 B 進行了定量分析。

方法性能通過長達 28 h 的胰dan、白酶時程消化實驗，我們考察了正常和高甘油三酯血癥樣品中胰dan白酶消化的完整度及其肽組成。將不同濃度的 Apo A-I（1.15、1.26、1.38、1.49 和1.60 g/L）和 Apo B（0.76、0.89、1.03、1.16和 1.29 g/L）與濃度 1 和濃度 3 基于血清的校準(zhǔn)樣品混合并分析，評價方法的線性和回收率。通過分別重復(fù) 5 次測定兩個混合血清 NPS1和 NPS2 中的一個樣品，對儀器的變異性進行評估。通過一天內(nèi)獨立測定 5 次樣品 (n =5)，以及在 5 天里每天制備并測定 3 個樣品(n = 15) 來確定運行內(nèi)差異和運行間差異。

結(jié)果肽選擇使用文獻中描述的 MRM 轉(zhuǎn)換在正?；旌涎逑a(chǎn)物中篩選 Apo A-I 和 B 特征肽。在 15 min 的色譜運行（CE 設(shè)置為 20 V 和15 V）中，采用 MRM 模式對所有離子對進行連續(xù)檢測，分析樣品。根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)肽的優(yōu)化結(jié)果，對于肽 VQPYL 和 DYVSQ (Apo A-I)，以及 VSALL 和 FPEVD (Apo B)，使用 18 V、19 V、24 V 和 20 V 的碰撞電壓值。選擇響應(yīng)強度最高的肽 DYVSQ、VQPYL、AKPAL、QGLLP 和 VSFLS (Apo A-I)，以及FPEVD、TEVIP、TGISP 和 SVSLP（未顯示）(Apo B) 進行 Apo A-I 和 B 定量分析的進一步評價。對于選中的肽，其最佳碰撞能量通過在 10 - 28 V 的范圍內(nèi)測定合成肽進行確定。dMRM 方法中選擇使定量子離子具有最佳響應(yīng)的碰撞能量（表 2）。

肽生成的完整性正常甘油三酯和高甘油三酯血癥血清樣品(n = 2) 消化產(chǎn)物中肽的生成見圖 2 和 3，并展示了肽 AKPAL、TGISP、QGLLP 和TEVIP 測定的實例。高甘油三酯血癥血清中 Apo A-I 和 B 肽的生成動力學(xué)與正常甘油三酯血清的類似。在4–8 h 內(nèi)，Apo A-I 的肽 AKPAL、QGLLP和 VSFLS 得到了*消化，而 VQPYL 和DYVSQ 則出現(xiàn)較慢。對于 Apo B，4 h 內(nèi)即出現(xiàn)肽 SVSLP、TEVIP 和 TGISP 的最大值，而 FPEVD 則需要 20 h。沒有使用 DYVSQ是由于其重現(xiàn)性很差。

線性和回收率Apo A-I 和 B 肽的線性見表 3 和圖 4。Apo A-I 肽的回收率在 92.6% - 103.1% 范圍內(nèi)，而 Apo B 肽的則在 94.4% - 105.6 % 范圍內(nèi)（圖 5）。對于 Apo A-I 和 B 的 LC/MS/MS 定量分析，在正常混合血清和高甘油三酯血癥樣品的進一步分析中，均使用了所有三種濃度的確定濃度的校準(zhǔn)樣品。重現(xiàn)性正常混合血清 (NPS) 中 Apo A-I 和 B 測定的重現(xiàn)性見表 4。對于 NPS 1 和 2，四種 Apo A-I 肽的運行間變異系數(shù)在 4.2% 到 8.6 % 之間，四種 Apo B肽的則在 4.2% 到 6.4 % 之間 (n = 15)。Apo A-I 肽 AKPAL，以及 Apo B 肽 TEVIP 和TGISP 具有最小的運行間變異系數(shù) (< 5%)。

結(jié)論聯(lián)用 Agilent 1290 Infinity LC 和 Agilent6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)，開發(fā)了一個用于多成分測定的 LC/MS/MS 方法，實現(xiàn)了血清 Apo A-I 和 B 的準(zhǔn)確定量分析。開發(fā)了可以同時測定血清 Apo A-I 和 B 的樣品制備方案，該方案可以產(chǎn)生正常和高甘油三酯血癥血清中這兩種蛋白的具有相似動力學(xué)特性的特征肽，并且僅需使用 5 µL 樣品（該分析混合物中實際只有 0.5 µL 血清）和 1 µg測序級胰dan白酶（酶與蛋白的比例為 1:35）。對于實現(xiàn)載脂蛋白準(zhǔn)確而可靠的定量分析，多種肽的細心選擇至關(guān)重要。使用確定濃度、基質(zhì)匹配的人血清校準(zhǔn)樣品進行 Apo A-I 和B 的校準(zhǔn)，這些校準(zhǔn)樣品采用和待測樣品同樣的樣品制備和測定程序。運行間變異系數(shù)在 5%–10% 范圍內(nèi)，說明方法具有穩(wěn)定的分析性能。我們采用 Agilent 1290 Infinity LC 和 Agilent6490 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)開發(fā)的 ApoA-I 和 B 的研究應(yīng)用方法，具有 Apo A-I 和B 多成分同時定量分析的潛力。我們還需要對該應(yīng)用進行更進一步的分析方法驗證，尤其是在高脂血癥血清中，以評價其將來在日常臨床化學(xué)中可能的應(yīng)用。