前言：藥物制劑中添加藥物賦形劑不是因?yàn)槠渚哂兄委熁钚?，而是為了?yōu)化生產(chǎn)過程，幫助提高制劑穩(wěn)定性或生物利用度，并提高患者的可接受性[1]。蔗糖 (C12H22O11) 是制藥行業(yè)中常用的甜味劑，常用于掩蓋口服藥物令人不快的味道，充當(dāng)防腐劑，以及提高液體藥物的粘度。為確保藥物制劑中使用的蔗糖的安全性和質(zhì)量，需要對雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測定。亞硫酸鹽是蔗糖中常見的雜質(zhì)。美國藥典方法 USP43-NF38-6076[2] 介紹了一種使用紫外-可見分光光度法測定蔗糖中總亞硫酸鹽含量的酶解方法。在本研究中，我們將展示 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計(jì)在根據(jù) USP 方法測定蔗糖中總亞硫酸鹽方面的優(yōu)勢。

 

實(shí)驗(yàn)部分背景USP43-NF38-6076 方法的原理是，在有氧條件下，亞硫酸鹽被亞硫酸鹽氧化酶氧化，生成硫酸鹽和過氧化氫，如下面的反應(yīng)方程式所示。（亞硫酸鹽氧化酶）SO32– + O2 + H2O SO42– + H2O2 (1)然后，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的存在下，生成的過氧化氫被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸過氧化物酶（NADH 過氧化物酶）還原，如下面的方程式 2 所示。（NADH 過氧化物酶）H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+ (2)反應(yīng)中生成的 NAD+ 的量與樣品中亞硫酸鹽的含量成正比。通過測量 340 nm 處的吸光度可以確定 NADH 的消耗量。通過計(jì)算空白和樣品反應(yīng)前后的吸光度差值 (A1–A2) 可以確定總亞硫酸鹽濃度。A1 為酶解反應(yīng)開始時(shí)的吸光度。A2 為酶解反應(yīng)結(jié)束時(shí)的吸光度。為了獲得 ?A亞硫酸鹽，用樣品的吸光度差(A1–A2) 減去空白的吸光度差 (A1–A2)。根據(jù)下面的公式，可以計(jì)算亞硫酸鹽濃度（以 SO2 計(jì)）[g/L]：C(總 so2) = V × Mol.Wt × ?A亞硫酸鹽 (3) ε × d × v其中：V = 最終體積 [mL]Mol.Wt = SO2 的分子量 [g/mol]ε = NADH 在 340 nm 處的消光系數(shù) = 6300[l × mol–1 × cm–1]d = 光程 [cm]v = 樣品體積 [mL]

 

實(shí)驗(yàn)部分樣品前處理樣品 1 和樣品 2 溶液：將 2.0 g 蔗糖（Sigma Aldrich，CAS 號(hào)57-50-1）溶于 5.0 mL 蒸餾水中，得到最終濃度為 400 mg/mL的樣品 1。使用 2.0 g 市售蔗糖（購自當(dāng)?shù)爻校貜?fù)上述流程制備得到樣品 2。亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液 (80 ppm SO2)：將 157.5 mg 無水亞硫酸鈉溶于 1.0 L 蒸餾水中，得到最終濃度 0.1575 mg/mL。參比溶液：將 4.0 g 蔗糖（Sigma Aldrich，CAS 號(hào) 57-50-1）溶于 5.0 mL 蒸餾水中。加入 0.5 mL 上述亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用蒸餾水將所得溶液稀釋至 10.0 mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液：將 1.0 g 檸檬酸加入 1.0 L 容量瓶中，并用 1.0 L 蒸餾水溶解。然后，準(zhǔn)確稱取 800 mg 無水亞硫酸鈉（Merck，CAS 號(hào) 7757-83-7）并加入溶液中（最終濃度約 400 mg/L，以 SO2 計(jì)）。用適量的 1 g/L 檸檬酸溶液稀釋儲(chǔ)備液，配制多個(gè)濃度的亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（0–400 mg/L，表 1）。

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7 個(gè)標(biāo)樣各自的濃度如表 1 所示。使用可選的 A g i l e n tOpenLab 軟件和儀器隨附的 Cary 紫外工作站軟件進(jìn)行檢測。OpenLab 提供了有助于滿足 21 CFR Part 11 和附錄 11 數(shù)據(jù)可靠性要求的工具。這些工具包括針對每次更改的可供檢索的審計(jì)追蹤。

 

結(jié)果與討論根據(jù) USP 方法定量分析蔗糖樣品中的總亞硫酸鹽為了根據(jù) USP43-NF38 專論方法測定蔗糖中的總亞硫酸鹽含量 (SO2)，應(yīng)在反應(yīng)開始 (A1) 和結(jié)束 (A2) 時(shí)記錄約 340 nm 處出現(xiàn)的最大吸光度。然后從這些值中扣除空白溶液獲得的相應(yīng)值。樣品溶液的吸光度差 (A1–A2) 不應(yīng)超過參比溶液吸光度差的一半。使用 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計(jì)測得的蔗糖樣品 1和樣品 2 的 ?A亞硫酸鹽分別為 0.0023 Abs 和 0.0044 Abs（表 5）。兩個(gè)樣品的 ?A亞硫酸鹽均小于參比的一半，并且在 USP 規(guī)定的可接受范圍內(nèi)。結(jié)果表明，Cary 3500 適用于蔗糖中亞硫酸鹽雜質(zhì)的測定。

標(biāo)準(zhǔn)溶液中總亞硫酸鹽的定量分析Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)可同步測量 8 個(gè)樣品池位置（7 個(gè)樣品和 1 個(gè)參比）。通過在反應(yīng)開始前、反應(yīng)過程中和反應(yīng)結(jié)束后，在 300–400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行 12 次掃描，在相同條件下同時(shí)監(jiān)測 7 個(gè)標(biāo)樣（圖 2）。同時(shí)測量多個(gè)樣品/標(biāo)樣的功能消除了環(huán)境和操作人員造成的分析誤差以及由此帶來的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性風(fēng)險(xiǎn)。Cary 紫外工作站動(dòng)力學(xué)應(yīng)用程序使分析人員可以選擇不連續(xù)的波長或特定波長范圍進(jìn)行掃描。使用 Cary 紫外工作站動(dòng)力學(xué)應(yīng)用程序同時(shí)測量 7 個(gè)標(biāo)樣各自的吸光度 (A1)。其方式為測量 300–400 nm 范圍內(nèi)的吸光度4 分鐘（12 次掃描）。然后，使用移液器將 20 µL 亞硫酸鹽氧化酶懸液依次加入每個(gè)標(biāo)樣中并混合。使用動(dòng)力學(xué)應(yīng)用程序，通過 45 分鐘內(nèi) 340 nm 處降低的吸光度來監(jiān)測 NADH 的消耗。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，使用表 3 中用于測量吸光度 (A1) 的相同參數(shù)（參數(shù) 2）測量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 (A2)。使用導(dǎo)出到 MSExcel 的數(shù)據(jù)，按照公式 3 計(jì)算總亞硫酸鹽 (SO2)。結(jié)果匯總于表 6 中。

監(jiān)測 NADH 隨時(shí)間的消耗情況Cary 紫外工作站動(dòng)力學(xué)應(yīng)用程序用于監(jiān)測添加亞硫酸鹽氧化酶后 NADH 的消耗情況。儀器同時(shí)測量 7 個(gè)標(biāo)樣，監(jiān)測 45 分鐘內(nèi)每個(gè)標(biāo)樣在 340 nm 處的吸光度（圖 3）。與每個(gè)標(biāo)樣單獨(dú)測量，總測量時(shí)間需要 5 多個(gè)小時(shí)相比，這種方法可節(jié)省大量的時(shí)間。Cary 3500 具有高數(shù)據(jù)采集速率（多達(dá) 250 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)/秒）和寬光度測量范圍，不含活動(dòng)部件。這些功能可確保在所有測量類型下均可采集準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

 

結(jié)論Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計(jì)能夠在單次實(shí)驗(yàn)中同步監(jiān)測 7 個(gè)標(biāo)樣中 NADH 的消耗情況。與單獨(dú)測量每個(gè)標(biāo)樣相比，這種方法可節(jié)省 5 個(gè)多小時(shí)的測量時(shí)間。同步測量還意味著 7 個(gè)標(biāo)樣均在相同的條件下進(jìn)行檢測，從而消除了任何測量變量（例如環(huán)境溫度的變化）。根據(jù) USP43-NF38 方法測定了蔗糖中的總亞硫酸鹽含量。同步測量多個(gè)樣品能夠盡可能減少環(huán)境、操作人員和儀器引入的誤差，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。可選的 Agilent OpenLab 軟件用于支持?jǐn)?shù)據(jù)采集過程的 Part 11/附錄 11 合規(guī)性。Cary 3500 可通過軟件控制的攪拌功能在整個(gè)測量期間混合樣品池中的所有反應(yīng)物。