前言：升高溫度可誘導(dǎo)雙鏈核酸分離為單鏈。在一定溫度下，堿基對(duì)之間的氫鍵發(fā)生斷 裂。熱熔實(shí)驗(yàn)利用了 DNA 腺嘌呤-胸腺嘧啶 (A=T) 與鳥嘌呤-胞嘧啶 (GΞC) 或 RNA 腺 嘌呤-尿嘧啶 (A=U) 和鳥嘌呤-胞嘧啶核苷酸之間氫鍵數(shù)的差異。由于 GΞC 核苷酸含 有三個(gè)氫鍵，解離所需熱能大于雙鍵對(duì)所需的熱能。這表示含有更多 GΞC 對(duì)的 DNA 和 RNA 要在更高的溫度下才能熔解。熔解溫度 (Tm) 可指示樣品中的堿基組成（GΞC 與 A=T/U=T 的比例）。 使用紫外-可見分光光度法測定熔點(diǎn)，利用的是單鏈核酸在 260 nm 處的吸光度高于 雙鏈核酸的原理[1]。圖 1 顯示了使用小干擾 RNA (siRNA) 樣品的示例，與 25 °C 相 比，85 °C 下 260 nm 處的吸光度明顯更高。

通常通過測定 260 nm 處的吸光度來進(jìn)行熱熔實(shí)驗(yàn)。然后在 受控 pH 和離子強(qiáng)度條件下逐漸升高樣品溫度。通常以每分鐘 0.5 °C 的速率升溫[2, 3, 4]。需要非常慢的升溫速率才能確保準(zhǔn)確 且可重現(xiàn)的數(shù)據(jù)。然而，緩慢的升溫速率也意味著實(shí)驗(yàn)需要 很長時(shí)間。例如，以每分鐘 0.5 °C 的速率將溫度從 20 °C 升至 95 °C 需要 2.5 小時(shí)。實(shí)驗(yàn)室通常需要重復(fù)這些測量以確保可 重現(xiàn)的結(jié)果，因此完整的熱熔實(shí)驗(yàn)可能十分耗時(shí)。 有很多方法可以縮短熱熔測量所需時(shí)間。例如，一些儀器能夠 將實(shí)驗(yàn)分成幾個(gè)階段，每個(gè)階段使用不同的升溫速率?？梢栽?開始和結(jié)束階段使用快速升溫速率，在樣品變性的溫度范圍內(nèi) 使用較慢的升溫速率。 分光光度儀器的新進(jìn)展大大縮短了熱熔測量所需的時(shí)間，溫 度精度比以往更高。Agilent Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分 光光度計(jì)使用集成的比色皿內(nèi)溫度探頭，可在實(shí)驗(yàn)過程中準(zhǔn)確 控制溶液溫度。多池支架內(nèi)置于儀器中，使用無水、風(fēng)冷的帕 爾帖控溫模塊將樣品溫度控制在 0–110 °C 之間。 本研究使用 Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分光光度計(jì)評(píng)估升 溫速率對(duì) siRNA 樣品熔解溫度 (Tm) 計(jì)算值的影響。

實(shí)驗(yàn)部分 樣品 siRNA 樣品由安捷倫核酸解決方案事業(yè)部提供。使用含 100 mmmol/L NaCl、0.1 nmmol/L EDTA 和 10 mmmol/L 磷 酸鈉的緩沖溶液配制 ≈ 0.3 mg/mL 的 siRNA 溶液，調(diào)節(jié)至 pH 7.0。 使用標(biāo)準(zhǔn) 3.5 mL 體積、10 mm 光程的石英比色皿。使用純磷 酸鹽緩沖液作為參比溶液。 儀器和方法 所有測量均采用 Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分光光度計(jì)。 方法參數(shù)見表 1。 研究期間改變的參數(shù)是升溫速率。共使用了八個(gè)升溫速 率：0.5、1、5、10、15、20、25 和 30 °C/min。 所有測量均使用至少三個(gè)平行樣品在相同條件下同步進(jìn)行測 量。將每個(gè)樣品比色皿與參比樣配對(duì)放置在八位多池支架 中。將比色皿內(nèi)溫度探頭插入每個(gè)樣品比色皿中（圖 2），該 探頭可用于控制實(shí)驗(yàn)溫度。

如圖 3 和表 2 所示，對(duì)于實(shí)驗(yàn)中使用的八個(gè)升溫速率，siRNA 樣品的測量 Tm 值誤差均在 ±1 °C 之內(nèi)。

結(jié)論 采用 Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分光光度計(jì)以八個(gè)不同 的升溫速率測量同一個(gè) siRNA 樣品的熔點(diǎn)。各個(gè)升溫速率下 測得的熔點(diǎn)誤差均在 ±1 °C 范圍內(nèi)，表示實(shí)驗(yàn)室可以使用比 0.5 °C/min 的常規(guī)方案更快的升溫速率。使用更快的升溫速率 可以在不影響結(jié)果的前提下大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。本研究表明， 使用 Cary 3500 可以在約 5 分鐘內(nèi)測定之前需要 2.5 小時(shí)才能 完成的實(shí)驗(yàn)。至少同步進(jìn)行三次重復(fù)測定同樣能夠大大節(jié)省分 析時(shí)間。 使用較快的升溫速率可擴(kuò)展到其他紫外-可見吸光度隨溫度變 化的測量，為進(jìn)行控溫實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室提供了顯著的分析效率優(yōu) 勢(shì)。能夠同步測量所有八個(gè)比色皿位置，進(jìn)一步提升了致力于 研究液體樣品對(duì)溫度變化響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室的分析效率。