摘要本文介紹了包含 300 多種農(nóng)藥的觸發(fā)式 MRM 數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)的開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于采用 120 種特定農(nóng)藥殘留開(kāi)發(fā)的 LC/MS 方法分析多種食品。我們使用了 Agilent 1290 Infinity LC 和6460 三重四極桿 LC/MS 聯(lián)用系統(tǒng)，并在采用安捷倫噴射流技術(shù)的正離子電噴霧模式下運(yùn)行。采用觸發(fā)式 MRM 采集模式進(jìn)行定量和確認(rèn)，以消除潛在的假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。針對(duì) 3 類商品的 5 個(gè)代表性基質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的室內(nèi)驗(yàn)證，證明了開(kāi)發(fā)的觸發(fā)式 MRM 方法滿足定量限 (LOQ)、線性和重現(xiàn)性等方面的要求，適用于食品提取物中農(nóng)藥的分析。一些實(shí)例表明，干擾基質(zhì)峰被錯(cuò)認(rèn)為是農(nóng)藥的高風(fēng)險(xiǎn)可以通過(guò)觸發(fā)式 MRM 消除。定量結(jié)果同時(shí)顯示的自動(dòng)化參考譜庫(kù)匹配可以高效地審查數(shù)據(jù)并對(duì)可疑數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)標(biāo)記。

 

前言食品，作為人類的一大消費(fèi)品，需要進(jìn)行農(nóng)藥殘留的分析。歐盟委員會(huì)法規(guī) (EC) 396/2005 及其在 2008 年 9 月生效的附錄中對(duì)歐盟生產(chǎn)或進(jìn)口到歐盟的食品和飼料產(chǎn)品的 170000 多種不同基質(zhì)中的多種農(nóng)藥規(guī)定了最大殘留* (MRL) [1]。SANCO/12495/2011 指南 [2] 中規(guī)定了食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析方法驗(yàn)證和質(zhì)量控制步驟的準(zhǔn)則。使用多殘留 LC/MS 分析方法監(jiān)測(cè)和定量數(shù)量與日俱增的農(nóng)藥?；谒鼈兂錾倪x擇性和靈敏度，分析者普遍認(rèn)為三重四極桿質(zhì)譜儀是定量多種食品中數(shù)百種低濃度農(nóng)藥的*佳儀器。然而，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)，一些案例已發(fā)現(xiàn)因基質(zhì)成分的保留時(shí)間與農(nóng)藥相近或相同而干擾農(nóng)藥的 MRM 譜圖，從而造成假陽(yáng)性的結(jié)果 [3]。某些時(shí)候，SANCO/12495/2011 規(guī)定的鑒定標(biāo)準(zhǔn)要求要有 2 個(gè)具有恒定離子比的 MRM transition，而保留時(shí)間并沒(méi)有足夠的選擇性來(lái)進(jìn)行對(duì)于明確的鑒定。因此，我們需要采集更多的 transition 或化合物的全譜。通常，這會(huì)影響方法可以涵蓋的化合物數(shù)量。觸發(fā)式 MRM 可以使二者同時(shí)實(shí)現(xiàn)，快速的循環(huán)時(shí)間實(shí)現(xiàn)幾百種化合物的分析方法和全譜采集。根據(jù)一個(gè)或更多主要 transition的響應(yīng)，可以最多被“觸發(fā)”9 個(gè)附加 transition，從而獲得與譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)的化合物全譜。所以，化合物的確認(rèn)不僅依據(jù)兩個(gè)主要 MRM transition 峰面積的比值，而且依據(jù)與參考譜庫(kù)的匹配得分。因?yàn)槊總€(gè)碎片都是在*優(yōu)化的碰撞能量下生成的，還因?yàn)樵谟|發(fā)式 MRM 下每個(gè)碎片的駐留時(shí)間明顯長(zhǎng)于全掃描下的駐留時(shí)間，因此，觸發(fā)式 MRM 的譜圖質(zhì)量要顯著優(yōu)于數(shù)據(jù)依賴的子離子掃描 [4]。此外，觸發(fā)式 MRM 通過(guò)安捷倫動(dòng)態(tài) MRM 算法進(jìn)行管理，確保了主要（定量）transition 循環(huán)時(shí)間的一致性。因此，觸發(fā)式 MRM 譜圖的采集不會(huì)影響數(shù)據(jù)采集速率和定量色譜峰的峰面積。

 

本文根據(jù)針對(duì)農(nóng)藥殘留分析的歐盟參考實(shí)驗(yàn)室 (EURL)“Checkyour-Scope”目錄，展示了包含適用于 LC/MS 分析的 300 多種最重要農(nóng)藥的觸發(fā)式 MRM 數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)的開(kāi)發(fā)過(guò)程，并將該觸發(fā)式MRM 采集模式應(yīng)用到不同食品（檸檬、西紅柿、綠茶和生姜）中 120 種農(nóng)藥殘留的分析中。對(duì)選定基質(zhì)的 QuEChERS 萃取液進(jìn)行加標(biāo)，濃度范圍從 1 µg/kg 到 100 µg/kg。以西紅柿、檸檬和綠茶 3 種食品為代表，根據(jù) SANCO/12495/2011 進(jìn)行了室內(nèi)驗(yàn)證。同時(shí)對(duì)觸發(fā)式 MRM 方法以及相應(yīng)的動(dòng)態(tài) MRM 方法的性能進(jìn)行了鑒定，包括根據(jù)信號(hào)的抑制或增強(qiáng) (SSE) 對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行的評(píng)估、線性測(cè)定、根據(jù)信噪比測(cè)定定量限 (LOQ)，以及通過(guò)不同加標(biāo)濃度的 5 個(gè)平行樣測(cè)定計(jì)算的重現(xiàn)性等。一些復(fù)雜基質(zhì)的實(shí)例表明，在一個(gè)或者兩個(gè)主要 MRM 譜圖上有干擾，但觸發(fā)式 MRM 提供的更多有價(jià)值的信息可以避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

 

實(shí)驗(yàn)試劑與化學(xué)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或 LCMS 級(jí)。乙腈和甲醇購(gòu)于 Baker公司（Mallinckrodt Baker，Deventer，荷蘭）；超純水用配有0.22 µm 濾膜過(guò)濾終端的 Milli-Q 集成系統(tǒng)制備（EMD Millipore，Billerica，MA，美國(guó)）；甲酸購(gòu)自 Fluka 公司（Fluka AG，Buchs，瑞士）；甲酸銨溶液 (5M) 來(lái)自安捷倫公司（部件號(hào) G1946-85021）；絕大多數(shù)農(nóng)藥分析標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Dr. Ehrenstorfer 公司（Augsburg，德國(guó)）。溶液與標(biāo)準(zhǔn)液根據(jù)其理化性質(zhì)的相似性，將單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，用乙腈配成8 個(gè)混標(biāo)，每個(gè)分別含有 30 到 40 種化合物，濃度均為 10 µg/mL，–20 °C 下保存。臨用前，將 8 個(gè)混標(biāo)進(jìn)一步混合，用乙腈配成濃度為 1 µg/mL，含有 300 多種化合物的農(nóng)藥混標(biāo)溶液。該溶液用于向 QuEChERS 萃取液中加標(biāo)和制備校準(zhǔn)樣品。用純乙腈制備范圍從 0.1 到 100 ng/mL 共 8 個(gè)濃度的校準(zhǔn)樣品。樣品前處理水果和蔬菜、干燥的菊花茶和綠茶均購(gòu)于當(dāng)?shù)氐氖卟怂?。根?jù)法定的檸檬酸鹽緩沖液的 QuEChERS 方法 [5]，采用安捷倫BondElut QuEChERS 試劑盒（部件號(hào) 5982-5650）進(jìn)行樣品前處理。稱取 10 g 均漿的水果和蔬菜，或者 2 g 菊花茶或綠茶，置于50 mL 塑料試管中。用 10 mL 超純水將菊花茶或綠茶浸濕。所有樣品均使用 10 mL 乙腈用力振蕩萃取 1 min。只有檸檬的勻漿液后來(lái)又加入 600 µL 5 M 的氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和。將含有 4 g 無(wú)水 MgSO4、1 g NaCl 和 1.5 g 緩沖檸檬酸鹽的萃取鹽包加入每個(gè)試管中使分層，將試管再振搖 1 min，并在 3000 rpm 的速度下離心 5 min。將 6 mL 上層乙腈液轉(zhuǎn)移至安捷倫 BondElut QuEChERS EN 分散型 SPE 萃取管中（部件號(hào) 5982-5256），該萃取管中含有用于凈化的 150 mg N- 丙基乙二胺 - (PSA) 和 15 mg 石墨化碳黑 (GCB)，以及用于去除水分的 900 mg MgSO4。將萃取管封閉，渦旋1 min。然后在 3000 rpm 的速度下離心 5 min。將澄清的萃取液轉(zhuǎn)移至玻璃樣品瓶中，向每毫升萃取液中加入 10 µL 5% 的甲酸乙腈溶液，以提高目標(biāo)農(nóng)藥的穩(wěn)定性。為了評(píng)估重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)，提取了空白西紅柿、生姜、檸檬、綠茶和菊花茶的樣品，并且通過(guò)向樣品的 QuEChERS 空白萃取液中加入適量的最終農(nóng)藥混標(biāo)溶液，配制成 3 個(gè)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品?；|(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)品配制完成后要立即進(jìn)樣分析，并平行測(cè)定 5 次。

 

儀器設(shè)備樣品分離使用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系統(tǒng)，包括 Agilent1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290 Infinity 高性能自動(dòng)進(jìn)樣器 (G4226A)，以及 Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)。UHPLC 系統(tǒng)與配備了安捷倫噴射流電噴霧離子源的 AgilentG6460A 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用。使用 MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

……

結(jié)論食品中農(nóng)藥的假陽(yáng)性鑒定是質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。在基質(zhì) - 農(nóng)藥組合存在的情況下，如果只采集 2 個(gè) MRMtransition，就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。在本文中，我們將觸發(fā)式 MRM 與譜庫(kù)參考譜圖檢索相結(jié)合，有效地消除了潛在的假陽(yáng)性結(jié)果。因?yàn)槊總€(gè) MRM transition 都使用了優(yōu)化的碰撞能量和合理的駐留時(shí)間，即使在非常低的濃度下和復(fù)雜的基質(zhì)中，觸發(fā)式 MRM 仍可以生成可靠的化合物譜圖。良好的線性校準(zhǔn)曲線和重復(fù)測(cè)定優(yōu)異的精密度表明，在觸發(fā)了附加 transition 進(jìn)行定性的情況下，定量結(jié)果未受到絲毫影響。觸發(fā)式 MRM 只需通過(guò)一次分析運(yùn)行，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量農(nóng)藥準(zhǔn)確的定性和定量。僅通過(guò)使用一個(gè)主要 transition，觸發(fā)式 MRM 能將多殘留方法分析化合物的范圍擴(kuò)大為目前以定量和定性 transition 為鑒定依據(jù)方法的 2 倍。該開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)作為安捷倫觸發(fā)式 MRM 譜庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分可供使用。其中包括了 600 多種農(nóng)藥的 transition、分析條件和譜圖，安捷倫產(chǎn)品部件號(hào)為 G1733CA，或者部件號(hào)G1733BA 產(chǎn)品，其中還包括了色譜柱、綜合農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)的應(yīng)用支持