前言：許多臨床研究實(shí)驗(yàn)室都非常關(guān)注甲狀腺激素水平的測(cè)定。甲狀腺素（3,5,3’,5’-四碘甲狀腺原氨酸，又稱 T4）是甲狀腺激素活性更強(qiáng)形式的三碘甲狀腺原氨酸（3,3’,5-三碘甲狀腺原氨酸，又稱 T3）的前體。反三碘甲狀腺原氨酸（3,3’,5’-三碘甲狀腺原氨酸，又稱 rT3）則是甲狀腺激素的非活性形式（圖 1）。在血液中循環(huán)的大多數(shù)甲狀腺激素都與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相結(jié)合。只有非常少量的循環(huán)甲狀腺激素是游離（非結(jié)合）狀態(tài)的，具有生物活性。因此，測(cè)定極低濃度的這三種游離甲狀腺激素對(duì)了解其在人體中的作用非常重要。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)報(bào)導(dǎo)了將 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)與配置 AJS 技術(shù)的 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)聯(lián)用，采用正離子電離模式建立了高靈敏度、準(zhǔn)確測(cè)定血清中游離和總甲狀腺激素的方法。該方法采用串聯(lián)質(zhì)譜 (MS/MS) 和多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)，在 0.5 到 1000 pg/mL 范圍內(nèi)線性良好，游離甲狀腺激素的定量下限 (LLOQ) 范圍為 1 到5 pg/mL，總甲狀腺激素為 0.5 到2.5 pg/mL。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和標(biāo)樣用 50:50 甲醇:30% 氫氧化銨配制 T4、T3、rT3及其13C標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)（購(gòu)自IsoSciences）10 µg/mL 儲(chǔ)備液。于 –20 °C 下保存。用甲醇稀釋儲(chǔ)備液來(lái)配制工作溶液。使用加入超低量激素和類固醇的血清（購(gòu)自Golden West Biologics）與不同量的儲(chǔ)備液配制濃度范圍 0.5 到 1000 pg/mL 的校正標(biāo)準(zhǔn)液。5 ng/mL 標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)混合液用甲醇配制。標(biāo)準(zhǔn)參比物 (SRM 971) 購(gòu)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 (NIST)。

儀器本方法采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)與 Agilent 6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)建立，后者配置 AJS，采用正離子模式。表 1 列出了儀器條件，6490 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的采集參數(shù)見表 2。

樣品前處理測(cè)定游離甲狀腺激素所用的校正溶液和標(biāo)準(zhǔn)參比物樣品通過(guò) Amicon CentrifugeYM-30 過(guò)濾器制得。將 500 µL 血清放入Amicon Centrifuge YM-30 過(guò)濾器中，高轉(zhuǎn)速下離心 2 小時(shí)。將 300 µL 濾液轉(zhuǎn)移至干凈的微量離心管中，加入 30 µL 內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行渦旋混合。加入 300 µL 乙腈，渦旋混合 1 分鐘，然后高轉(zhuǎn)速離心10 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至 96 孔板中。對(duì)這些樣品分別用醋酸乙酯進(jìn)行液液萃取(LLE) 測(cè)定總甲狀腺激素。取 200 µL 樣品置于試管中，加入 20 µL 內(nèi)標(biāo)和 400 µL乙腈，然后進(jìn)行渦旋混合。1.2 混合液中加入 1.2 mL 醋酸乙酯，渦旋混合 60 秒。以 13000 rpm 離心該試管 10 分鐘，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到干凈試管中，然后進(jìn)行蒸發(fā)。干燥后的樣品用120 µL 75:25水:乙腈復(fù)溶。

結(jié)果與討論方法性能由于 MRM transition 技術(shù)的普遍使用，T3 和 rT3 的色譜分離也就極為重要。圖 2顯示游離甲狀腺素或總甲狀腺素分析得到的三種形式甲狀腺激素均實(shí)現(xiàn)了基線分離。校正曲線線性良好，在 0.5 到 1000 pg/mL范圍內(nèi)的變異系數(shù) (R2) ≥ 0.990。與總甲狀腺素相比，游離甲狀腺素的 R2 值略高（圖 3）。

方法靈敏度高，游離激素的 LLOQ 范圍為 1 到 5 pg/mL，總甲狀腺素為 0.5 到2.5 pg/mL（表 3）。游離和總甲狀腺激素的色譜圖表明，可以對(duì)極低濃度的分析物進(jìn)行定量測(cè)定（圖 4）。

結(jié)論建立了同時(shí)分析血清中甲狀腺素 (T4)、3,3’,5-三碘甲狀腺原氨酸 (T3) 和 3,3’,5’-三碘甲狀腺原氨酸 (rT3) 的高靈敏度而特異的 LC/MS/MS 方法。測(cè)定低 pg/mL表 3. 人血清甲狀腺激素的 LLOQ分析物游離 LLOQ(pg/mL)總 LLOQ(pg/mL)T4 5 1T3 1 0.5rT3 5 2.5水平的游離甲狀腺激素需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的過(guò)濾前處理，而測(cè)定總甲狀腺需要進(jìn)行液液萃取。