前言：QuEChERS 方法最初用于水果和蔬菜中的農(nóng)藥萃取 [1]。QuEChERS 操作分為兩個步驟，萃取/分配和分散 SPE（dSPE）。在第一步中，乙腈作為萃取溶劑；使用硫酸鎂和鹽促進分配/萃取。在第二步中，采用 d-SPE 去除萃取物中的基質(zhì)干擾。d-SPE 的材料一般包括 N-丙基乙二胺（PSA）、封端C18（C18EC）和石墨化碳黑（GCB）。通過驗證，QuEChERS 方法已被用于多種樣品基質(zhì)的處理。相比于水果和蔬菜，本文涉及到的動物源食品樣品需要在 d-SPE過程中采用 PSA 和 C18EC 去除這類樣品中增加的蛋白質(zhì)和脂類干擾。本文分析的獸藥不需要使用 QuEChERS 緩沖鹽，即原 AOAC或 EN QuEChERS 方法系用于萃取 pH 不穩(wěn)定農(nóng)藥的鹽。本方法由于其高選擇性和高靈敏度，在分析復(fù)雜食品基質(zhì)中痕量級的目標(biāo)農(nóng)藥時非常耐用和快速。與固相萃?。⊿PE）相比，QuEChERS 方法會帶來更多的基質(zhì)干擾，因為它是一種“剛好夠用"的樣品制備技術(shù)。因此，需要高選擇性的儀器，如使用帶 DMRM 檢測模式的 LC/MS/MS 對獸藥進行簡便準(zhǔn)確的分析。采用本文描述的 LC/MS/MS 方法，動物源食品中的 36 種獸藥可以在 9 min 內(nèi)實現(xiàn)有效的分離。本法聯(lián)用快速 QuEChERS 萃取，減少了大量操作步驟和分析人員的時間，為常規(guī)工作中獸藥的篩查提供了一個可靠的方法。

實驗部分試劑與標(biāo)準(zhǔn)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 級或者分析純。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）購自 Honeywell 公司（馬斯基根，密歇根州，美國）。甲酸（FA）和乙酸購自 Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國）。

溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液將 1 mL 甲酸加入 100 mL ACN 中，混勻，制備 1% 甲酸 ACN 溶液，每天新鮮配制。將 1 mL 乙酸加入 100 mL ACN 中，混勻，制備 1% 乙酸 ACN 溶液，每天新鮮配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的濃度為 10 µg/mL（磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類）、5 µg/mL（氯吡多）和 1 µg/mL（喹諾酮類）。儀器與材料配備二極管陣列檢測器的 Agilent 1260 HPLC （安捷倫科技有限公司，加利福尼亞州，美國）。帶有 AJST 電噴霧離子源的 Agilent 6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司，加利福尼亞州，美國）。Agilent Bond Elut QuEChERS 硫酸鎂（部件號 5982-8082）Agilent Bond Elut 氯化鈉（部件號 5982-5750）Agilent Bond Elut PSA（部件號 5982-8382 或 5982-5753）Agilent Bond Elut C18EC（部件號 5982-1382 或 5982-5752）Agilent Bond Elut SAX（部件號 12213042）Agilent Bond Elut NH2（部件號 12213021）藥物殘留分析用 Agilent Bond Elut d-SPE（部件號 5982-4956）Agilent Bond Elut QuEChERS 不帶緩沖鹽萃取試劑盒（部件號5982-5550）Agilent ZORBAX Solvent Saver HD Eclipse Plus C18，3.0 ×100 mm，1.8 µm 色譜柱（部件號 959757-302）

樣品制備樣品勻漿空白的豬肉、牛奶、蜂蜜和雞蛋樣品購自當(dāng)?shù)匾患译s貨店。樣品洗凈并剁碎（視需要），然后于 -20 °C 保存。萃取取 2 克（±0.05 g）各樣品（視需要勻漿），置于 50 mL 離心管中。向樣品中加入 200 µL 獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為 10 ng/g（磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類）、5 ng/g （氯吡多）和 1 ng/g （喹諾酮類）。加入 4 mL 水，渦旋樣品 1 min。每管中加入 10 mL1% 乙酸 ACN 溶液。蓋上離心管并渦旋 1 min。 將萃取鹽（4 gNa2SO4，1 g NaCl）加入各管中。樣品管加蓋并且劇烈振搖1 min。 在 4 °C 下以 5000 rpm 的速度離心 5 min，放置 30 min。分散 SPE取 6 mL 上層 ACN 相，轉(zhuǎn)移至裝有 50 mg PSA、150 mg C18EC和 900 mg 無水 Na2SO4的 15 mL 試管中。將試管蓋緊，渦旋 1 min，然后以 5000 rpm 的速度離心 5 min。將 4 mL 上層 ACN 相轉(zhuǎn)移至另一試管中，40 °C 下氮氣吹干。用 1 mL ACN/H2O 溶液（2 : 8）復(fù)溶樣品殘渣，然后以 10000 rpm 的速度離心 10 min。將上層相溶液轉(zhuǎn)移至自動進樣瓶中。

結(jié)果與討論色譜條件優(yōu)化Agilent 1260 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)在 600 bar 的最高壓力下可快速獲得質(zhì)量的數(shù)據(jù)結(jié)果。結(jié)合使用 Eclipse Plus C18亞 2 µm 填料色譜柱，該分析系統(tǒng)可以改善分離度，縮短分析時間，提高檢測靈敏度，這些改進對于獸藥篩查都極為重要。Agilent6460 MS/MS 系統(tǒng)具有高檢測靈敏度，先進的六極桿碰撞池可以消除背景噪音和交叉污染，并且創(chuàng)新的動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（DMRM）方法在 LC 分離過程中即可根據(jù)每個分析物的保留時間窗建立離子對列表。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中 36 種獸藥（磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類 10 ng/g、氯吡多 5 ng/g 和喹諾酮類 1 ng/g）的 LC/MS/MS 分離狀況見圖 1。每種化合物的 MS 條件見表 1。

萃取和分散 SPE 參數(shù)的改進在初始評價階段，我們使用安捷倫 Bond Elut 無緩沖鹽和用于藥物殘留的 Bond Elut QuEChERS d-SPE 試劑盒。在方法開發(fā)期間，我們發(fā)現(xiàn)有必要改進操作步驟。這些改進可以使回收率滿足常規(guī)分析的要求，詳情如下所述。這個方法已成功應(yīng)用于如下樣品基質(zhì)的處理：肉類、蜂蜜、蛋類和奶類。萃取步驟的優(yōu)化首先，藥物殘留的 d-SPE 過程（150 mg C18，900 mg MgSO4）在方法1、2、3 和 4（表 2）中使用，以評價萃取步驟改進的效果。萃取鹽包QuEChERS 方法使用 MgSO4 去除樣品中的水分。實驗表明，MgSO4 的使用對許多化合物的回收率有負(fù)面影響，尤其是磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物。用 Na2SO4 替代 MgSO4，并且離心后將樣品靜置 30 min，可以有效地吸收水分 [2]。結(jié)果表明，用 Na2SO4替代 MgSO4，可以提高磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的回收率（表 2中的方法 1 和方法 2）。

萃取溶劑在萃取步驟中，還對水/乙腈的比例進行了評價。結(jié)果表明，萃取步驟中，采用比例為 1 : 2 的水/乙腈時，其回收率較比例為 1 : 1時的好（表 2 中的方法 2 和方法 3）。肉類基質(zhì)的許多樣品制備技術(shù)中常用酸去切斷化合物-蛋白質(zhì)的結(jié)合，這會直接影響其回收率。通常用于這種目的的酸是甲酸和乙酸 [3]。經(jīng)比較表明，采用含 1% 乙酸的乙腈溶液處理樣品的回收率大于采用含 1% 甲酸的乙腈溶液的處理效果。（表 2 中的方法 3和方法 4）。在四個方法的評價中，林可霉素的回收率都很低。推測是由于林可霉素具有強極性（log P = 0.56），限制了乙腈對它的萃取。

表 3 的結(jié)果表明，方法 1 和 5 實現(xiàn)了回收率，它們分別采用了添加或不添加 PSA 的 C18EC。我們的目的是可以找到一個適用于我們所有樣品基質(zhì)的 d-SPE 處理方法。因此，在 d-SPE 過程中使用 PSA 非常重要，因為它可以去除蜂蜜基質(zhì)中普遍存在的有機酸和糖。 最終選擇的 d-SPE 參數(shù)為 50 mg PSA、150 mgC18EC 和 900 mg Na2SO4。其它樣品基質(zhì)除了肉類基質(zhì)，本方法也成功用于蛋類、奶類和蜂蜜基質(zhì)樣品的處理。這些基質(zhì)樣品的回收率良好，滿足常規(guī)獸藥定量分析要求（附錄 I）。

結(jié)論采用改進的 QuEChERS 方法，結(jié)合使用 LC/MS/MS，可以成功實現(xiàn)省時的動物源基質(zhì)樣品中磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和氯吡多獸藥的篩查。本文優(yōu)化的最佳 QuEChERS 組成為：4 g Na2SO4、1 g NaCl 作為萃取鹽，乙腈（1% 乙酸）作為萃取溶劑，d-SPE 過程中使用 50 mg PSA、150 mg C18EC 和 900 mg Na2SO4。改進的QuEChERS 方法回收率滿足常規(guī)獸藥篩查的要求。