前言作為一大類新型藥物，抗體代表了重組產(chǎn)生的治療性蛋白中最大的一類。這些治療劑的療效與其糖基化模式正確與否高度相關(guān)，迄今為止，所有獲得許可的治療性單克隆抗體 (mAb) 均是免疫球蛋白 G (IgG)1。因此，糖基化模式分析是質(zhì)量保證/質(zhì)量控制 (QA/QC) 過程的一個重要部分。此外，患者血漿中 IgG 的糖基化模式可以反映其健康狀態(tài)2。人 IgG含有一個保守的 N-連接糖基化位點(diǎn)，它位于每條重鏈 Fc 區(qū)的 Asn-297 位3。這使得每個 IgG 分子含有高度異質(zhì)性的兩個糖基，并會產(chǎn)生至少 30 種糖型的混合物1。血漿中的人 IgG N-連接多糖主要為二天線復(fù)合型結(jié)構(gòu)，大多數(shù)包括核心巖藻糖并具有 0-2 個半乳糖殘基和 1-2 個唾液酸。此外，人 IgG 還攜帶有少量的二等分 N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc) 殘基。一般而言，缺失非巖藻糖化或二等分 GlcNAc多糖結(jié)構(gòu)，基本不會降低重組單克隆抗體(mAbs) 的模式復(fù)雜性4。同時，還發(fā)現(xiàn)了其他更多未成熟結(jié)構(gòu)，例如像 mannose-5一樣的高甘露糖型結(jié)構(gòu)，雖然它們的量大都較低5。

 

蛋白糖基化模式的分析挑戰(zhàn)性，特別是因?yàn)閺?fù)雜生物樣品中多糖分析物的豐度常常很低。利用親水相互作用色譜(HILIC)-HPLC 結(jié)合熒光檢測器分離 AB 標(biāo)記的多糖結(jié)構(gòu)是一種穩(wěn)定、靈敏的多糖分析方法6。在本應(yīng)用簡報(bào)中，我們使用了這種方法并檢驗(yàn)了其精密度、線性和靈敏度。圖 1 顯示了本應(yīng)用簡報(bào)中所用的多糖結(jié)構(gòu)、亞型及命名，它們也曾用于之前的出版物中7。根據(jù)所連的末端半乳糖殘基數(shù)量，將與 IgG 連接的多糖劃分成不同的亞型，如圖 1b 所示。G0、G1 和 G2 分別含有 0、1 和 2 個末端半乳糖殘基。

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實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)中所用的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)包括以下模塊：• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵(G5611A)• Agilent 1260 Infinity 高性能生物惰性自動進(jìn)樣器 (G5667A)• Agilent 1290 Infinity 自動進(jìn)樣器控溫器 (G1330B)• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)• Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢測器 VL (G1315D)，配有生物惰性標(biāo)準(zhǔn)流通池，10 mm• Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器(G1312B)，配有生物惰性 FLD 流通池色譜柱TOSOH TSK-GEL Amide-80 色譜柱，2 ×150 mm，3 µm軟件Agilent OpenLAB CDS，用于 LC 及 LC/MS 系統(tǒng)的 ChemStation 版本，Rev.C.01.02 [14]溶劑及樣品緩沖液 A：100 mM 甲酸銨溶液，pH 4.5緩沖液 B：乙腈

 

多糖標(biāo)準(zhǔn)品• GLYKO2-AB（- 人IgGN-連接多糖文庫），200 pmol• GLYKO 2-AB-(MAN-5) & Man5，100 pmol• GLYKO 2-AB-(NA2) & G2，100 pmol• GLYKO 2-AB(A1) & G2S1，100 pmol• GLYKO 2-AB-(A1F) & G2FS1，100 pmol• GLYKO 2-AB-(A2) & G2S2，100 pmo

 

所有的多糖標(biāo)準(zhǔn)品均溶于 50 µL 100 mM的甲酸銨溶液，pH 值為 4.5。所有的溶劑均為 LC 級。超純水由配有0.22 µm 使用點(diǎn)折疊膜濾芯 (Millipak) 的Milli-Q Integral 系統(tǒng)現(xiàn)制。甲酸銨購自西格瑪奧德里奇公司（美國圣路易斯）。AB 標(biāo)記的多糖標(biāo)準(zhǔn)品購自 Prozyme 公司（美國海沃德）。

結(jié)果與討論AB 標(biāo)記的人 IgG 標(biāo)準(zhǔn)品 N-多糖的可重現(xiàn)分析圖 2 為 AB 標(biāo)記的人 IgG N-連接多糖文庫的色譜分離圖。存在于人 IgG 中的所有主要的多糖結(jié)構(gòu)均得到了很好的分離。對于峰標(biāo)記，采用多種文獻(xiàn)中的命名法 3, 8, 9。所有主要的多糖均核心巖藻糖化，具有 0、1 或 2個半乳糖基化結(jié)構(gòu)，具體見表 1。除了單唾液酸化的 G2FS1（最后一個峰）之外，所有的多糖均為中性結(jié)構(gòu)。

使用人 IgG N-連接多糖文庫，我們測定了 5 次連續(xù)進(jìn)樣的保留時間和峰面積的精密度。所有多糖結(jié)構(gòu)的保留時間精密度均低于 0.16%，峰面積精密度在 0.66% 到4.11% 之間，具體見表 2。所有測得的保留時間和峰面積的 RSD 值均在通常報(bào)道的范圍內(nèi)10。線性將 5 種多糖標(biāo)準(zhǔn)品（Man5、G2、G2S1、G2FS1 及 G2S2）的混合物按 1:3 比例連續(xù)稀釋，得到 0.008 至 1 pmol 的濃度范圍，然后計(jì)算線性。圖 3 為 5 種 N-多糖混合物的色譜分離圖，其中柱上樣量為1 pmol。

信噪比 (S/N) 為 3 時，檢測限 (LOD) 在 10到 15 fmol 之間。信噪比 (S/N) 為 10 時，定量限 (LOQ) 在 34 到 51 fmol 之間。所有校正曲線均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)均大于 0.999，具體見表 3。FLD 檢測器的光電倍增管 (PMT) 增益設(shè)為 14 以提高靈敏度。此外，使用 Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器分析多達(dá) 4 種不同的激發(fā)和發(fā)射波長時，需要對方法進(jìn)行優(yōu)化，最終設(shè)置激發(fā)波長為260 nm，發(fā)射波長為 430 nm。這種組合波長相比多糖分析中常用的波長（例如Anumula 200511 中所推薦的）所得的峰強(qiáng)度要高得多。

 

結(jié)論本應(yīng)用簡報(bào)證實(shí)了對于AB 標(biāo)記的人 IgGN-連接多糖，配有熒光檢測器的 Agilent1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)其高靈敏度高重現(xiàn)性 HPLC 分析的理想系統(tǒng)。人 IgG N-連接多糖文庫的分析表明，所有主要的多糖結(jié)構(gòu)均得到了良好的分離。保留時間精密度低于 0.16%，峰面積精密度在 0.66% 和 4.11% 之間。所有測得的保留時間和峰面積的 RSD 值均在通常報(bào)道的范圍內(nèi)10。根據(jù) Campbell 等人12 提出的結(jié)構(gòu)指認(rèn)軟件可知，保留時間的高精密度對于正確指認(rèn)多糖結(jié)構(gòu)具有極其重要的意義。

 5 種多糖標(biāo)準(zhǔn)品（Man5、G2、G2S1、G2FS1 及 G2S2）的混合物按 1:3 的比例連續(xù)稀釋，得到 0.008 至 1 pmol 的濃度范圍，然后計(jì)算線性。所有校正曲線均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)均大于 0.999。檢測限 (LOD) 在 10 到 15 fmol 之間，定量限 (LOQ) 在 34 到 51 fmol 之間。優(yōu)化 Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器的熒光波長后，峰強(qiáng)度更高，并因此使所得的信噪比更佳。其中，激發(fā)波長并沒有使用 330 nm（由 Anumula 200512 推薦），而是使用了更低的 260 nm。配有熒光檢測器的 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)是對 2-AB 衍生的 N-連接多糖進(jìn)行高靈敏度高重現(xiàn)性HPLC 分析的*佳系統(tǒng)。