摘要：本文應用安捷倫 7000 系列氣相色譜串聯(lián)質譜 (GC/MS/MS) 建立了豆奶中八種植物雌激素（包括鷹嘴豆芽素 A (biochanin A)，香豆雌酚 (coumestrol)，大豆黃酮 (daidzein)，雌馬酚 (equol)，芒柄花素 (formononetin)，染料木黃酮 (genistein)，大豆黃素 (glycitein)和櫻黃素 (prunetin)）的分析方法。用乙酸乙酯液液萃取法提取豆奶中植物雌激素，用三甲基氯硅烷 (TMCS) 和 N, O-雙（三甲硅基）三氟yi酰胺 (BSTFA) 將分析物衍生成相應的醚，通過在不同裂解電壓下形成的子離子和母離子推斷各植物雌激素的裂解模式，得到各分析物相應的質譜圖。由質譜裂解結果可知，各植物雌激素典型的裂解模式是失去甲基和羰基。每種分析物選擇兩個特征碎片離子進行鑒定、確認和定量分析。本方法適用于豆奶中植物雌激素的鑒定、確認和定量分析，且校準曲線的范圍可達三個數(shù)量級。

引言植物雌激素是天然存在于多種植物中的一組非類固醇多酚化合物，它通過與雌激素受體結合誘導生物學反應。通常它們在豆科植物中的含量很高，例如大豆，三葉草，紫花苜蓿，黃豆和豌豆 [1]。類黃酮化合物（由 2-苯基-1，4-苯并吡喃酮衍生而來的水溶性植物色素）對人類的有益影響曾有報道 [2]，而且它們有清除自由基的作用。然而，伴隨著廢水中的合成激素和人類雌激素的排放，植物雌激素也被認為是潛在的魚類內(nèi)分泌干擾物 [3]。此外，在經(jīng)常進食（每周進食兩次以上）大豆食品的北美男性中發(fā)現(xiàn)植物雌激素，尤其是大豆黃酮，染料木黃酮和大豆黃素會導致精子數(shù)量減低 [4]。因為植物雌激素的排放不僅來源于植物也來源于人類和牲畜的食物攝取，因此評估食品中植物雌激素的來源以及地表水和廢水中植物雌激素濃度十分必要。我們小組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)大豆加工廠的廢水會引起地表水中含有一定濃度的大豆黃酮和染料木黃酮 [5]。目前，已有幾種定性和定量分析類黃酮化合物的方法，包括氣相色譜法和液相色譜法 [6, 7]。在豆奶這種復雜基質中，由于基質干擾作用，具有選擇性的離子阱或串聯(lián)質譜法（液相色譜串聯(lián)二級質譜或氣相色譜串聯(lián)二級質譜）成為了確認這些待測物的主要分析方法?？傮w來說氣相色譜的相關檢測方法對植物雌激素有很高的分離能力和低檢測限，但是需要通過衍生化使其變?yōu)槿谆杳蜒苌镆栽鰪娖鋼]發(fā)性和改善熱穩(wěn)定性。二級質譜聯(lián)用技術(MS/MS) 通過監(jiān)測二個或三個特征碎片離子能夠充分表征硅烷化植物雌激素，因此它比單一離子監(jiān)測技術選擇性高。本文使用 Agilent 7000 氣相色譜三重串聯(lián)四級桿質譜聯(lián)用設備對豆奶中的八種植物雌激素進行鑒定和確認（表 1）。通過每種分析物的特征碎片離子對各植物雌激素進行鑒定。

實驗部分樣品制備與衍生化步驟鷹嘴豆芽素 A (biochanin A)，香豆雌酚 (coumestrol)，大豆黃酮(daidzein)，雌馬酚 (equol)，芒柄花素 (formononetin)，染料木黃酮 (genistein)，大豆黃素 (glycitein) 和櫻黃素 (prunetin) 購于Sigma Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國）。衍生化試劑N, O-雙三甲基硅基三氟yi酰胺 (BSTFA)，三甲基氯硅烷 (TMCS) 購于 Sigma Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國）。取 500µL的 TMCS 加入到 5mL 的 BSTFA 中得到 10 % 的 TMCS 衍生化試劑。同樣的方法將 2 mL 吡啶加入到 8 mL BSTFA 中得到 BSTFA吡啶 (4:1; v:v) 溶液，在進入氣相色譜之前把它添加到干提取物中。甲醇和乙酸乙酯購于 Burdick and Jackson 公司（馬斯基根，密歇根州，美國）。所有的分析材料和試劑均為分析純。各種植物雌激素標樣均由甲醇配制成濃度為 500 mg/L 的溶液。將這些溶液稀釋成工作液用于衍生化反應和 GC/MS/MS 分析。所有標準溶液均儲存在 –20 oC 冰箱中，使用前在室溫平衡至少 2 小時。用雙三甲基硅基三氟yi酰胺 (BSTFA) 和三甲基氯硅烷 (TMCS) 將分析物衍生成其三甲基硅醚。首先在硅烷化的 5mL 反應瓶中用氮氣將校準物質吹干。然后加入 200µL 10% TMCS/BSTFA 衍生化試劑，渦旋 15 s。反應瓶放在加熱器中 60 oC 保持 1 小時。將小瓶取出放置 15 min 冷卻，然后用氮氣將試劑吹干。最后將干的殘留物溶于 200µL 用于進樣的 4:1 BSTFA 吡啶溶液，渦旋振蕩 30秒。用干凈的玻璃吸管將衍生化的提取物轉移到自動進樣瓶中，使用氣相色譜/質譜/質譜 (GC/MS/MS) 分析。使用乙酸乙酯作為提取溶劑建立了一個簡單快速的從豆奶中提取植物雌激素方法。豆奶樣品 (1 mL) 使用 5 mL 乙酸乙酯液-液萃取，氮氣吹干后加入 TMCS 和 BSTFA/吡啶，在 60 oC 衍生化 1 小時。

GC/MS/MS 儀器條件植物雌激素的氣質法鑒定使用Agilent 7890氣相色譜/ Agilent 7000三重串聯(lián)四極桿質譜（Agilent，圣克拉拉，加利福尼亞州，美國）。色譜分離使用安捷倫 J&W HP-5 色譜柱（5 % 苯基，95 %聚甲基硅氧烷），30 m × 0.25 mm 內(nèi)徑熔融石英毛細管柱（安捷倫，圣克拉拉，加利福尼亞州，美國）內(nèi)部膜厚度為 0.25 µm。載氣為氦氣，恒定流速為 1.2 mL/min 由電子壓力控制系統(tǒng)調節(jié)。進樣口溫度為 280 oC，不分流進樣。程序升溫為 100 oC（保持1 min）40 oC/min 升溫至 240 oC（保持 1 min）10 oC/min 升溫至300 oC（保持 4 min）。質譜條件如下：正離子監(jiān)測模式 (EI+)，使用自動增益控制 (AGC)，裂解電壓為 –70 eV。離子源溫度為300 oC。增益電壓為 30。每個 MRM transition 的駐留時間為50msec。進樣量為1 µL。儀器控制和數(shù)據(jù)分析軟件為MassHunter。

結果與討論GC/MS/MS 條件的優(yōu)化最初的試驗包括兩部分內(nèi)容，首先是確定每種植物雌激素母離子的最大響應值，除鷹嘴豆芽素 A，染料木黃酮和櫻黃素三種物質的母離子為 [M+•–CH3•] 以外，其它幾種分析物的母離子均為其分子離子峰（見表1）。其次，選擇合適的裂解電壓以得到每種化合物的定性和定量離子 transition，裂解電壓范圍在 10-40 V，優(yōu)化后的 MRM（多反應監(jiān)測模式）transitions 如表 2 所示。表 2 列舉了所有分析物的母離子和主要碎片離子，在有些情況下，碎片離子會發(fā)生三甲基硅烷 (TMS) 基團丟失，比如染料木黃酮和櫻黃素，其他情況下，會發(fā)生一個甲基或一個甲基和一個羰基丟失，并伴隨結構重排，圖 1 為大豆黃酮的詳細裂解模式，選擇這些碎片離子對于分析物的定量和鑒定非常重要，而這通常不涉及TMS 基團丟失。因此，對每種分析物來講，根據(jù)其相對豐度選擇兩個離子碎片進行定性和定量。與其他分析物不同，染料木黃酮丟失了由兩個 TMS 基團組成的質核比為 72 的碎片，沒有出現(xiàn)一個甲基和一個羰基的典型碎片丟失。

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分析方法驗證分別配置 0.1、0.5、1、5、10、50 和 100 µg/L 的標準溶液做校準曲線，結果表明，所有分析物在 1-100 µg/L 范圍內(nèi)線性關系良好，圖 3是大豆黃素的線性曲線，其中，相關系數(shù) R2均大于 0.99，表 3 是各種分析物的儀器最檢出限 (LOD)，檢出限是大豆黃酮和櫻黃素，芒柄花素的靈敏度低（響應值/濃度信號），因此 LOD 較高，批次內(nèi)和批次間分析的變異系數(shù) CV (n=3) 范圍為2-8 %，說明方法重現(xiàn)性良好。豆奶中的分析應用圖 4 是從當?shù)厥称飞痰曛匈徺I的豆奶的色譜圖，其中，檢出的染料木黃酮 (16000 µg/L) 和大豆黃酮 (7000 µg/L) 是豆奶中常見的兩種植物雌激素，另外，本方法也檢出了含量較低的大豆黃素(760 µg/L)，為了避免儀器信號超載，兩種含量較高的分析物均被稀釋以后進樣，圖4中還顯示了染料木黃酮的兩種 MRM transition和相應的離子比例，如圖中所示，由于儀器的靈敏度和 MRMtransition 的高選擇性，植物雌激素類化合物很容易被鑒別出來

由于分析物是比較復雜的樣品，在使用 GC/MS/MS氣質聯(lián)用儀 時，保證儀器的相互適配是非常重要的，尤其是離子源和色譜柱。因此，在分析復雜樣品尤其是雜質含量高的樣品時，推薦使用反吹 [8]。

結論本文建立了八種植物雌激素（鷹嘴豆芽素 A，香豆雌酚，大豆黃酮，雌馬酚，芒柄花素，染料木黃酮，大豆黃素和櫻黃素）的三甲基硅烷衍生物的 GC/MS/MS 分析鑒定方法。研究結果顯示，安捷倫 7000 系列三重串聯(lián)四極桿串聯(lián)質譜在分析豆奶樣品中植物雌激素時穩(wěn)定靈敏度高可靠性好。另外，通過在碰撞池中對母離子進行裂解研究了八種植物雌激素的裂解模式，結果表明，分析物典型的碎片丟失是失去甲基和羰基，為了定性定量準確，每種化合物選擇兩種碎片離子。本方法適用于豆奶中植物雌激素的鑒別和確認。