摘要 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)與 Agilent 6460A 三重串聯(lián)四極桿 LC/MS 系統(tǒng)聯(lián)用的分析性能。 內(nèi)容包括： • 采用干血斑（DBS）技術(shù)在僅 15 µL 的全血中提取一系列藥物 • 采用新型 ZORBAX 超高壓快速高分離度（RRHD）亞 2 µm 粒徑色譜柱在接近 1200 bar 的反壓下進(jìn)行快速色譜/質(zhì)譜分離 • 在不到 50 秒的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)七種小分子藥物混合物的高效分離的檢測(cè)靈敏度

引言 采用 LC/MS/MS 技術(shù)進(jìn)行生物分析中的定量 檢測(cè)可能被認(rèn)為是藥代動(dòng)力學(xué)（PK）篩查的里 程碑。臨床前在體內(nèi)藥物篩查包括以先導(dǎo)化合 物向大量動(dòng)物（一般為小鼠或大鼠）給藥，并監(jiān) 測(cè)動(dòng)物血清中的藥物隨時(shí)間的吸收和衰減?，F(xiàn) 在，在早期藥物發(fā)現(xiàn)階段即需進(jìn)行 PK 分析， 這樣就能夠以預(yù)先找出最有可能通過(guò)后續(xù)藥物 開(kāi)發(fā)階段的新型化合物（NCE），并針對(duì)它展開(kāi) 接下來(lái)的工作。然而，考慮到可能面對(duì)的大量 的 NCE，必須盡早迅速、廉價(jià)地剔除其中的非 藥物化合物，因此需要很短的樣品處理周期1。 “盒式給藥法"（又名“雞尾酒"或 “N-inone"）是一種廣泛用于加快 PK 篩查的 給藥方法。是指以幾種藥物對(duì)同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行 同步給藥。這種平行測(cè)試方法有利于減少動(dòng)物消 耗、動(dòng)物處理、以及樣品制備和分析時(shí)間。還可 以平息倫理上的爭(zhēng)議，并可節(jié)約相當(dāng)?shù)某杀?-4。 本文對(duì)含有六種藥物的組合藥物進(jìn)行了 LC/MS/MS 生物分析。主要目的是得到不犧牲 色譜分離度和/或靈敏度前提下的最高分析性 能。研究中使用了一臺(tái)配備 RRHD 短柱（50 x 2.1 mm ID，1.8 µm）的 Agilent 1290 Infinity LC 系統(tǒng)，在柱壓為 1200 bar 時(shí)，流速最高可 達(dá) 2 mL/min5。該 LC 系統(tǒng)與 6460A 三重串聯(lián) 四極桿 LC / MS 聯(lián)用可提供靈敏度以及高 流速條件下無(wú)需分流即可進(jìn)行質(zhì)譜分析的能力。 安捷倫噴射流技術(shù)可以提供上述的高流速6。采用干血斑（DBS）技術(shù)7-10 從小體積全血樣 品中提取組合藥物。與傳統(tǒng)的臨床前和臨床分 析血漿取樣技術(shù)相比，DBS 技術(shù)有其優(yōu) 點(diǎn)。例如，在臨床前研究實(shí)驗(yàn)室，由于制備 DBS 樣本對(duì)血液量的要求較低，因此在實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物數(shù)量減少的情況下仍然能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)采 血，這有助于消除個(gè)體差異。除相關(guān)的倫理和 費(fèi)用方面的優(yōu)勢(shì)外，該技術(shù)還可提高 PK 數(shù)據(jù) 的質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)部分 試劑 所有標(biāo)準(zhǔn)品（右美沙芬、維拉帕米、甲氧戊脈 安、丙咪嗪、普羅替林和曲米帕明 （ISTD）、甲酸（FA）、 均購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司（德國(guó)）。HPLC 級(jí)水購(gòu)自 Burdick & Jackson 公司（美國(guó)）。 HPLC 級(jí)乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）購(gòu)自 Merck 公司（德國(guó)）。 樣品制備 用乙腈/水（50:50 V/V）將各化合物分別制備成 約 2 mg/mL 的溶液。將這七種儲(chǔ)備液 I 混合， 使其中六種待測(cè)藥物濃度相等（100µg/mL）， 得到儲(chǔ)備液 II。將儲(chǔ)備液 II 稀釋得到空白和濃 度在 0.5ng/mL 到 5000ng/mL 范圍內(nèi)的一系 列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在 90µL 大鼠血中加入10µL 不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到相應(yīng)的空白和濃度為 0.05ng/mL 到 500ng/mL 的樣品溶液。

DBS 提取步驟 FTA Elute MicroCard（FTA 卡）購(gòu)自 Whatman （英國(guó)）。圖 1 顯示了 15µL 的血液加標(biāo)樣品 的干血斑（左）。用 Harris Uni-Core 打孔器 （Sigma-Aldrich，德國(guó)）從干血斑上取下 6mm 直徑的樣品點(diǎn)。如圖 1 所示，打孔器取樣后血 斑邊緣仍然存在（右）。樣品點(diǎn)被放入一個(gè) 2ml 離心管中，加 100µL 的乙腈/水 60:40 v/v （2% FA）。渦流混合幾秒后，超聲提取 15 分 鐘。在 15000 rpm 下離心后，將血斑提取液轉(zhuǎn) 移到干凈的樣品瓶。為了簡(jiǎn)化樣品制備過(guò)程， 不對(duì) 60% 的乙腈提取物進(jìn)行復(fù)溶和稀釋?zhuān)?直接向 LC/MS 系統(tǒng)進(jìn)樣。

設(shè)備 • Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)，由內(nèi)置 脫氣機(jī)的 1290 Infinity 二元泵、帶溫控器的 Infinity 1290 自動(dòng)進(jìn)樣器和 1290 Infinity 柱 溫箱組成 • 采用安捷倫噴射流技術(shù)的 Agilent 6460A 三 重串聯(lián)四極桿的 LC/MS 系統(tǒng) • 安捷倫 MassHunter Workstation 軟件，用 于儀器控制、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理 • 安捷倫 MassHunter Optimizer 軟件 • 安捷倫超高壓快速高分離度（RRHD） ZORBAX Eclipse Plus - C18 色譜柱， 2.1 x 50mm，1.8µmAgilent 1290 Infinity 方法 溶劑 A： 水 [0.1%甲酸] 溶劑 B： 甲醇 [0.1%甲酸] 梯度： t (min) % B 0 40 1 60 1.2 90 1.7 90 1.9 40 流速： 1 mL/min T (色譜柱)： 50°C 停止時(shí)間： 2 分鐘 后運(yùn)行時(shí)間： 1 分鐘 進(jìn)樣量： 3 µL 洗針： 15 秒 乙腈/水 60/40 v/v （0.1% TFA）

Agilent 6460A 三重串聯(lián)四極桿 LC/MS 工作條件 掃描模式：MRM（采用 MassHunter Optimizer 軟件得到表 1 中的參數(shù)設(shè)置） 電離方式：采用安捷倫噴射流技術(shù)的正離子 ESI 干燥氣溫度： 300°C 干燥氣流量： 11 L/min 霧化器壓力： 35 psig 毛細(xì)管電壓： 2250 V 鞘氣溫度： 400°C 鞘氣流量： 12 L/min 噴嘴電壓： 0 V

結(jié)果與討論 高通量的組合給藥樣品分析 在復(fù)雜樣品分離中實(shí)現(xiàn)高通量常需要在分析速 度和分離質(zhì)量（即色譜分離度，Rs ）兩方面進(jìn) 行權(quán)衡。圖 2（A）說(shuō)明了當(dāng)前組合給藥樣品 中相鄰峰之間的分離度同流速之間的關(guān)系。在 此圖中，保持梯度洗脫時(shí)間不變，逐次將流動(dòng) 相流速調(diào)高。（研究表明在梯度洗脫時(shí)間不變 時(shí)，提高流速可得到更好的分離度11）。測(cè)試 范圍為 0.6 mL/min 到 1.75 mL/min，相應(yīng)的 最高柱壓（pmax）為 470 bar 到 1160 bar； 圖 2（A）中也顯示了柱壓和流速的關(guān)系。 最高的流速可產(chǎn)生極快的分離速度，如圖2（B） 所示，流速為 1.75 mL/min 時(shí)保留化合 物的保留時(shí)間僅為 27 秒（曲米帕明，7 號(hào)峰）。 即使對(duì)于“單化合物"分析，這樣的速度也意 味著分析通量。然而在組合給藥的樣品 分析中，這種超快的流速是以犧牲分離度為代 價(jià)的。正如圖中所示的甲氧戊脈安和丙咪嗪這 一對(duì)接近的峰（圖 2 中的峰對(duì) 3/4）的分離 度。注：已報(bào)道的盒式給藥研究往往忽略了色 譜分離的需要，以避免離子抑制效應(yīng)。

然而，圖 2（A）表明，先進(jìn)的技術(shù)使得快速且 高品質(zhì)的分離成為可能。流速在 0.6 mL/min 到 1 mL/min 之間時(shí)，大多數(shù)相鄰峰都沒(méi)有出 現(xiàn)明顯的分離度變化，即使是接近的峰對(duì) （3/4），在 1 mL/min 時(shí)分離度仍可達(dá)到 1 左右。圖 3 中的重疊 MRM 色譜圖顯示七個(gè)混 合物標(biāo)樣可在 1 分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)色譜分離（流速 1 mL/min；pmax = 740 bar；通常 Rs 大于 1； RTmax 等于 42 秒）。相應(yīng)的分析時(shí)間為 3 分 鐘，該分析時(shí)間可與“單化合物"PK 分析相近 （通常需要 3 到 5 分鐘），而盒式給藥樣品分析 往往需要更長(zhǎng)的分析時(shí)間（不小于 6 分鐘）2-9。