摘要本應(yīng)用介紹了在 1290 超高性能液相色譜/6460A 串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀上利用極性切換及和盒式分析技術(shù)進(jìn)行代謝物穩(wěn)定性研究的方法。這種 UHPLC/MS/MS 方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：• 高通量分析（在流動(dòng)相流速 1.5 mL/min，泵壓為 1,100 bar 條件下，保留時(shí)間小于0.8 min）• 快速的 MS/MS 分析，周期僅為 114 ms，在極性切換(極性切換速度是 30 ms)的模式下可以采集 6 個(gè) MRM transitions• 優(yōu)異的峰面積[%]或相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）精度[%]，即使對(duì)于半峰寬為0.37 秒的組分峰，也能得到足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)（至少 9 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)）• 使用內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)校準(zhǔn)曲線得到的結(jié)果精度為 90.7%-107.1%• 極性切換模式或單極性模式得到的分析結(jié)果（殘留原藥的百分?jǐn)?shù)，%）接近• 出色的色譜分離度避免了由于源內(nèi)碰撞解離將代謝物轉(zhuǎn)化成母體藥物而導(dǎo)致的定量分析結(jié)果偏高。

前言體外藥物的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）研究，例如代謝物穩(wěn)定性研究，對(duì)于早期認(rèn)識(shí)藥物體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特征并及時(shí)摒棄在藥物開(kāi)發(fā)后期會(huì)失敗的非藥物類化合物具有重要意義。因此，需要建立快速分析方法以進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)早期階段涉及的大量化合物的篩查分析。通常使用盒式分析和快速 LC/MS/MS 方法進(jìn)行代謝物穩(wěn)定性評(píng)估研究。在盒式分析過(guò)程中，為了減少需要分析的樣品數(shù)量，需要對(duì)孵育后的混合底物進(jìn)行正相或負(fù)相的離子化。使用高流速和亞 2 微米填料色譜柱的快速液相色譜方法可以減少分析時(shí)間并提高分析通量[1, 2]。通常采用串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)分析。盒式分析的目的是，將能在正離子模式或負(fù)離子模式下底物組分混和在一起進(jìn)行液質(zhì)分析。其原因在于,對(duì)于快速液相色譜得到很窄的色譜峰，質(zhì)譜分析如果無(wú)法以足夠快的速度對(duì)單個(gè)峰采集到九至十個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，那么就無(wú)法保證定量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。然而，將能在正離子模式或負(fù)離子模式下底物組分混和在一起仍然顯現(xiàn)了其靈活性的優(yōu)點(diǎn)。本項(xiàng)工作介紹了幾種技術(shù)聯(lián)用的優(yōu)點(diǎn)，不僅使用盒式分析和快速液相色譜，而且利用快速極性切換的 MS / MS 分析以提高分析效率和在代謝物穩(wěn)定性研究中的靈活性, 同時(shí)保證良好的準(zhǔn)確度和精度。而且，安捷倫 1290 Infinity LC的流量范圍達(dá) 2 毫升/分鐘時(shí)其泵壓力可以達(dá)到 1200 bar，這保證了臨界峰之間的良好分離度。

實(shí)驗(yàn)化學(xué)試劑和備件鹽酸維拉帕米購(gòu)自 SigmaAldrich (St. Louis, MO USA)。右美沙芬(Dextromethorphan), 雙氯芬酸(diclofenac)和去甲右美沙芬-d3 (內(nèi)標(biāo)) 購(gòu)自 Cerilliant (RoundRock, TX USA)。氘代 d4-雙氯芬酸(苯基氘代d4) 購(gòu)自 CDN Isotopes (Quebec, Canada)。還原型輔酶 II（NADPH）再生系統(tǒng)，溶液 A (b-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽 (NADP), 葡萄糖-6-磷酸和氯化鎂水溶液)和溶液 B (葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的 5 mM 檸檬酸鈉溶液)以及.5 M 磷酸鉀溶液, pH 7.4 購(gòu)自 BD Biosciences。其它的試劑盒有機(jī)溶劑都是分析級(jí)并購(gòu)自 VWR。

鼠肝的底物的孵育 S9 餾分第一階段代謝（phase I metabolism）的孵育混合物由相當(dāng)于 0.3 mg 蛋白質(zhì)的 S9 組分，1 µM底物（鹽酸維拉帕米，右美沙芬或雙氯芬酸，它們是用濃度為 100 µM 儲(chǔ)備液經(jīng)70%水/ 30%乙腈制備而來(lái)），1.3 mM 的 b-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽 (NADP)，3.3 mM 葡萄糖-6-磷酸，3.3 mM 氯化鎂溶液和0.1 M 磷酸緩沖液配制的 0.4 U/mL 的葡萄糖6-磷酸脫氫酶（pH 7.4)，制備成總體積為 300 µL的溶液。在 37°C 下進(jìn)行孵育。孵育后制成四種底物的混合溶液以降低分析時(shí)間。取 25 µL0, 5, 10, 15, 25 和 35 min 時(shí)的孵育液，用 300 µL含有去甲右美沙芬-d3 和氘代 d4-雙氯芬酸的乙腈溶液停止反應(yīng)，然后在 14000 g 下離心 10 分鐘。取上清液，然后緩緩地用氮?dú)獯蹈?。用?.1%甲酸的水/乙腈（80/20 v/v）的溶液再溶解，用于 UHPLC/MS/MS 分析。儀器Agilent 1290 Infinity 液相色譜配置：• 1290 Infinity 集成脫氣機(jī)的高壓二元泵, 1290溫控自動(dòng)進(jìn)樣器和 1290 柱溫箱• Agilent 6460A 噴射流離子聚焦三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀• Agilent MassHunter 質(zhì)譜工作站用于數(shù)據(jù)的采集和處理• Agilent MassHunter Optimizer 方法優(yōu)化軟件• Agilent Zorbax SB-C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm色譜柱

Agilent 1290 Infinity 液相色譜分析方法流動(dòng)相為:A 相: 含 0.1%甲酸的水溶液B 相: 含 0.1%甲酸的乙腈溶液進(jìn)樣體積: 1 µL洗針: 在洗針座用含 0.1%甲酸的甲醇水（50/50 v/v）溶液洗針 20 秒U(xiǎn)HPLC 方法 1:柱溫: 25°C 或 40°C流速: 1.0 mL/min梯度: 25% B 保持 0.2 min, 在 1 min 80% B, 在1.25 min 80% B, 在 1.26 min 25% B, 停止時(shí)間：1.8 minUHPLC 方法 2:柱溫: 60 °C流速: 1.5 mL/min梯度: 25% 保持 0.2 min, 在 0.73 min 80% B, 在1.00 min 80% B, 在 1.01 min 25% B, 停止時(shí)間：1.5 minAgilent 6460A 三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)條件：掃描模式: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MassHunter 優(yōu)化軟件幫助您快速獲得最佳的碰撞電壓和碰撞解離能量，已經(jīng)優(yōu)化好的質(zhì)譜參數(shù)參見(jiàn)表 1, 2和 3)極性：正/負(fù)切換模式，正模式或負(fù)模式參 數(shù)：干 燥 氣溫度： 350°C, 干 燥 氣流速 :10 L/min, 鞘流氣溫度: 400°C 鞘流氣流速:12 L/min, 霧化器壓力: 35 psig, 錐口電壓: 0 V (+)1000 V (-), 毛細(xì)管電壓: 4,000 V (+/-)正負(fù)切換速度: 30 ms

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結(jié)果與討論快速極性切換模式下采集速度和數(shù)據(jù)結(jié)果的質(zhì)量在高流速（1.0 mL/min 或 1.5 mL/min）和高壓（至 1,100 bar）的條件下的超高性能液相色譜分離，分離時(shí)間僅需 1.5 min，但組分的半峰寬小于 1 秒（一般是 0.4 至 1.0 sec)。由于質(zhì)譜分析具有很低的循環(huán)時(shí)間，所以針對(duì)每個(gè)峰能采集到足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)(> 9 數(shù)據(jù)點(diǎn))，這樣就保證了定量結(jié)果的精確度(峰面積 RSD [%] 和相對(duì)峰面積 RSD [%] = 目標(biāo)組分的峰面積/ 內(nèi)標(biāo)組分的峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 < 10%)。圖 1 是流速在1.5 和 1.0 mL/min 條件下，MRM 離子流圖，數(shù)據(jù)質(zhì)量和分析時(shí)間的結(jié)果比較。如果要得到好的定量分析結(jié)果，則要求每個(gè)峰需要 9-10 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。組分峰越窄，質(zhì)譜檢測(cè)器就需要具有越高的采集速度。質(zhì)譜分析的周期被縮短。在每個(gè)循環(huán)周期內(nèi)，質(zhì)譜需要采集在正負(fù)切換下的 6 個(gè) MRM transitions。圖 2 是 30ms 的正負(fù)切換速度和 114 ms 的循環(huán)時(shí)間周期的條件下雙氯芬酸的分析結(jié)果。圖中顯示組分峰的半峰寬 0.37 sec，每 個(gè)峰的數(shù)據(jù)點(diǎn)是9 個(gè)，所以峰面積和相對(duì)峰面積的精度很好，分別是 4.8 和 7.9%。