摘要四環(huán)素類抗生素最頻繁地被用于畜牧行業(yè)中。本文介紹了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)牛奶和動(dòng)物組織中的 10 種抗生素殘留，包括二甲胺四環(huán)素、差向土霉素、差向四環(huán)素、四環(huán)素、差向金霉素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、多西環(huán)素和土霉素。安捷倫固相萃取柱和反相 Agilent ZORBAX RX C8 column (5 µm, 150 mm × 2.1 mm)色譜柱在此方法中被用于樣品的純化和分離。各組分的檢測(cè)限介于 0.5 至 10.0 µg/kg 之間，定量限(LOQ) 小于 50 µg/kg。 線性校正曲線的范圍是 5 至 1000 µg/kg?？偦厥章试?6.4% 至 101% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD, n = 6) 小于 8.4%。本方法快速、靈敏、方便、可靠，可以用于牛奶中多殘留四環(huán)素及其代謝物的同時(shí)檢測(cè)。

前言抗生素在世界范圍內(nèi)被廣泛地用于控制細(xì)菌感染和促進(jìn)健康家畜的奶產(chǎn)量。四環(huán)素類抗生素是一類廣普抗生素，因而被廣泛使用。但是，在奶及奶制品中含有這些抗生素會(huì)影響奶的安全性。美國(guó)食品藥品管理局(FDA) 限定了四環(huán)素，包括土霉素和金霉素的日允許攝入量(ADI)和牛奶中允許xian量。這些化合物總殘留的日允許攝入量(ADI)是每天每千克體重 25 微克。日允許攝入量(ADI)的60%是用于牛奶，40% 是可食組織。根據(jù)日允許攝入量（ADI），牛奶中四環(huán)素類，包括土霉素、金霉素和四環(huán)素的總殘留xian量不能超過(guò) 300ppb。四環(huán)素的總殘留被設(shè)定為 300ppb，三種四環(huán)素中每個(gè)組分的閾值為 300ppb 也能被接受。在歐盟，根據(jù)歐盟 2377/90 號(hào)法令建立的牛奶中四環(huán)素的最大殘留xian量為 100 µg/kg (100 ppb)。在中國(guó)，國(guó)標(biāo) (GB/T 21317-2007)也設(shè)定了牛奶和動(dòng)物組織中這些化合物的確定方法。該法規(guī)于2008 年 4 月 1 日正式生效。本研究的目的是建立利用 Agilent 6410 LC/MS/MS 系統(tǒng)檢測(cè)牛奶中四環(huán)素及其代謝物的方法。本方法快速而易用。四環(huán)素及其代謝物的結(jié)構(gòu)見表 1。

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實(shí)驗(yàn)部分化學(xué)試劑和化學(xué)品液相色譜級(jí)的水和甲醇，以及甲酸全部購(gòu)自 Fluka。標(biāo)準(zhǔn)品都購(gòu)自Sigma-Aldrich。

樣品前處理提取步驟：1. 稱 5 克牛奶樣品（精確至 0.01 g）加入到 50 毫升比色管中，溶于 0.1 M/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液，定容至 50 毫升2. 渦旋震蕩 1 分鐘，提取液在冰水混合液中超聲 10 分鐘3. 將樣品轉(zhuǎn)移至 50 毫升聚丙烯離心管中并冷卻至 0 °C ~ 4 °C4. 樣品在 15 °C 下， 5000 r/min 離心 10 分鐘5. 快速濾紙過(guò)濾凈化：1. 取 10 毫升提取液（相當(dāng)于 1g 樣品），倒入安捷倫 SampliQOPT 型固相萃取柱（部件號(hào) 5982-3036），速度為每秒一滴2. 當(dāng)它洗脫后，調(diào)節(jié) 3 mL 水至 pH 4.5 清洗固相萃取柱，然后丟棄所有流出物3. 在 2.0 kPa 的負(fù)壓下，抽固相萃取柱 5 分鐘4. 用 10 mL 的 10 mmol 乙二酸的甲醇溶液洗脫5. 收集洗脫液，在 40 °C 下氮?dú)獯抵粮?. 用 1 mL 的初始流動(dòng)相溶解殘留物7. 用 0.45 µm 的濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)樣

結(jié)果與討論優(yōu)化和分離碰撞誘導(dǎo)解離電壓和碰撞能量(CE)優(yōu)化，三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)是識(shí)別、確認(rèn)和定量食品基質(zhì)中目標(biāo)化合物的最佳工具。為了獲得最高的響應(yīng)，僅僅每個(gè)組分的兩個(gè)參數(shù)被用于質(zhì)譜優(yōu)化，即碰撞誘導(dǎo)解離電壓和碰撞能量。合適的碰撞誘導(dǎo)解離電壓是為了將母離子傳輸至質(zhì)量分析器。合適的碰撞能量提供合格子離子的最高豐度的定量。一種優(yōu)化方法是在一次運(yùn)行中設(shè)定不同的碰撞誘導(dǎo)解離電壓段來(lái)多次進(jìn)樣。圖 1 是二甲胺四環(huán)素采用該方法的圖示。結(jié)果表明，對(duì)于二甲胺四環(huán)素，隨著電壓增加，母離子響應(yīng)增加很少。采用同樣的方式優(yōu)化碰撞能量，四環(huán)素的結(jié)果見圖 2。

最近安捷倫公司推出了方法自動(dòng)優(yōu)化（Optimizer）程序，它可以自動(dòng)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離電壓和碰撞能量的優(yōu)化，最后將優(yōu)值存于 Optimizer 數(shù)據(jù)庫(kù)中。 利用這個(gè)程序和帶色譜柱或不帶色譜柱的流動(dòng)進(jìn)樣模式，用戶只要輸入要優(yōu)化的化合物名稱和分子式即可。表面質(zhì)量會(huì)根據(jù)分子式自動(dòng)被計(jì)算出來(lái)。用戶需要正模式或負(fù)模式下可能的加合物、小質(zhì)量去除、任何需要排除的離子以及需要采用的方法（流動(dòng)相條件等）。一旦開始運(yùn)行，程序通過(guò)用戶選擇的一次進(jìn)樣增加量開始進(jìn)樣，確定母離子并利用步進(jìn)式的電壓梯度進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離電壓的優(yōu)化。然后程序選擇電壓產(chǎn)生最高豐度的母離子。圖 3 是四環(huán)素采用該方法的結(jié)果。

隨后二次進(jìn)樣開始進(jìn)行子離子掃描，然后選擇四個(gè)最高豐度的子離子。重復(fù)進(jìn)樣并運(yùn)行 MRM 采集每個(gè)離子的碰撞能量。那些生成信號(hào)子離子響應(yīng)的碰撞能量會(huì)自動(dòng)確定并存入數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于四環(huán)素碰撞能量的結(jié)果列于圖 4，圖 5 是離子碎裂曲線。帶子離子的化合物會(huì)直接被導(dǎo)入用戶的現(xiàn)有分析方法中。