摘要：基因毒性雜質(zhì)的測(cè)定是制藥行業(yè)非常關(guān)注的問(wèn)題，定量測(cè)定的主要難點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)足夠高的靈敏度。由于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）具有高靈敏度和高選擇性，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)被用于對(duì)這類雜質(zhì)進(jìn)行定量。采用快速色譜可以實(shí)現(xiàn)高通量，并耗費(fèi)較短的分析時(shí)間，并且可以提高色譜分離度

本研究使用安捷倫 6410串聯(lián)質(zhì)譜和 1200系列 RRLC，對(duì)氯己定中的 4-氯苯胺（一種降解產(chǎn)物）進(jìn)行了定量測(cè)定。在0.3 ng/mL 到 1000 ng/mL 的寬濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)> 0.9998。檢測(cè)限（LOD）為 0.2 ng/mL，定量限（串聯(lián)質(zhì)譜）為 0.3 ng/mL。

前言芳香胺類由于具有親電性，能與 DNA 形成強(qiáng)共價(jià)鍵，從而阻止了 DNA 的正確復(fù)制，被認(rèn)為可以導(dǎo)致基因突變。4-氯苯胺是氯己定 (1, 1'-(己烷-1, 6-)雙胍基])的降解產(chǎn)物，后者是牙科廣泛使用的活性組分。加熱可以促進(jìn) 4-氯苯胺的生成 1。該化合物毒性很強(qiáng)，可以導(dǎo)致溶血和高鐵血紅蛋白血癥 2,3。這說(shuō)明了建立一種對(duì)氯己定中 4-氯苯胺穩(wěn)定而靈敏的定量方法非常重要。本應(yīng)用報(bào)告報(bào)導(dǎo)了一種簡(jiǎn)便而靈敏的LC/ESI/MSMS 方法，能夠檢測(cè)氯己定中0.2 ng/mL 濃度水平的 4-氯苯胺。氯己定和 4-氯苯胺的分子結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

實(shí)驗(yàn)化學(xué)藥品及試劑氯己定 和 4-氯苯胺購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司。所有溶劑均為 HPLC 級(jí)。甲醇購(gòu)自Merck 公司，甲酸購(gòu)自 Fluka 公司，采用Millipore 超純水。儀器和色譜條件所有分析均使用安捷倫 6410B 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜與 1200 系列 RRLC 系統(tǒng)聯(lián)用。RRLC 系統(tǒng)組件包括安捷倫 1200 系列二元泵 SL，配置脫氣機(jī)，安捷倫 1200 系列自動(dòng)進(jìn)樣器 SL 和安捷倫 1200 系列柱溫箱SL。用安捷倫 MassHunter 工作站軟件（版本：B.01.04）進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。

所有色譜分離均采用安捷倫 ZORBAXEclipse Plus C18, 4.6 mm × 100 mm,1.8 µm 色譜柱。 流動(dòng)相有機(jī)相為含 0.1%甲酸的甲醇，水相為含 0.1%甲酸的水。線性梯度從 50%有機(jī)相開(kāi)始，三分鐘至 70%。繼續(xù)維持 B 百分含量 1 分鐘。梯度后時(shí)間為 3 分鐘。用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣 6 µL，打開(kāi)沖洗口沖洗 10 秒鐘。樣品溫度設(shè)置為 15℃。二元泵流速為 700 µL/min。柱溫箱設(shè)置在40℃。稀釋液是水相和有機(jī)相 1:1 預(yù)先混合的溶液。質(zhì)譜參數(shù)列于表 1。4-氯苯胺的監(jiān)測(cè)離子為 m/z: 128 和 93 (定量)、 m/z: 128 和 111 (定性)， 氯己定為m/z: 505.4 和 184.3。所有離子的駐留時(shí)間均為 200 ms/離子。樣品制備用稀釋劑將濃度為 500 μg/mL 的 4-氯苯胺儲(chǔ)備液稀釋成需要的濃度。配制的線性濃度分別為 0.2 (LOD), 0.3 (LOQ), 0.4, 0.5,0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10,25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000 ng/mL4-氯苯胺。每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣 3 次，用其響應(yīng)值繪制線性曲線。

線性范圍內(nèi)各濃度的準(zhǔn)確度（以百分比表示）良好，平均值為 102.2 ± 9%。所有濃度的準(zhǔn)確度值列于表 2。

結(jié)論我們建立了穩(wěn)定而靈敏的氯己定中 4-氯苯胺的 LC/ESI/MSMS 定量測(cè)定方法。該方法具有較寬的線性范圍 0.3 ng/mL (LOQ)到 1000 ng/mL，相關(guān)系數(shù)>0.9998。所測(cè)LOD 為 0.2 ng/mL。 各線性水平的濃度準(zhǔn)確度約為 102.2 ± 9.7%。實(shí)驗(yàn)表明，安捷倫6410B 三重四極桿 LC/MS 能夠精確測(cè)定痕量基因毒性雜質(zhì) 4-氯苯胺