摘要本應(yīng)用報(bào)告報(bào)道了：• 高分離度快速液相色譜（RRLC）分析三七方法的方法建立• 從常規(guī)HPLC到RRLC方法轉(zhuǎn)換的結(jié)果• 用RRLC方法在保持復(fù)雜組分良好分離度的同時(shí)，縮短了分析時(shí)間，同時(shí)提高了樣品通量、降低了成本• 用優(yōu)化方法得到的色譜圖顯示，從三七不同部位得到的樣品色譜峰輪廓不同，某些皂甙的濃度也不同

前言中藥（TCMs）具有悠久的用藥歷史，其療效在中國(guó)及韓國(guó)、日本等亞洲國(guó)家都得到認(rèn)可。在西方國(guó)家，也越來越普遍地將中藥作為食品添加劑或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑。被使用過的中藥已經(jīng)有11,000多種。對(duì)中藥的研究和質(zhì)量控制很大程度上依靠?jī)x器分離和分析的性能。本研究建立了一種分析三七的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法。用安捷倫方法轉(zhuǎn)移器輕松地將常規(guī)HPLC 分析方法轉(zhuǎn)為 RRLC 方法。用不同提取方法從三七植物的不同部位制備不同樣品 。用優(yōu)化的方法分離這些樣品，得到的色譜圖顯示了不同的色譜峰輪廓。本應(yīng)用報(bào)告還報(bào)道了定量結(jié)果。質(zhì)控部門使用本研究中建立的更快、更好的方法，將縮短分析時(shí)間，提高樣品通量。使用這些方法還能節(jié)省溶劑消耗，改善整個(gè)分析過程。三七，中文名三七或田七，在中國(guó)是一種重要而昂貴的藥材。它已經(jīng)有400多年的栽培歷史，85%以上的三七都產(chǎn)自中國(guó)云南省。三七的功效在于促進(jìn)血液循環(huán)、去除血液瘀積包括凝血，治療腫脹、緩解疼痛。最近的藥理學(xué)研究顯示，三七具有抗癌和保肝作用，如，對(duì)心血管和腦血管系統(tǒng)有保護(hù)作用1。三七的皂甙種類與著名的人參和西洋參 (花旗參)相似，因?yàn)樗鼈兌紝儆谕环N屬。三七主要用于中國(guó)南方的不同驗(yàn)方。著名的中成藥云南白藥和片仔癀中也含有三七。中藥的復(fù)雜基質(zhì)常常給質(zhì)量控制和研究帶來挑戰(zhàn)。2005版中國(guó)藥典收載了藥材三七及其復(fù)方制劑，如三七傷藥片，其中含有三七皂甙R1，是這些制劑中必須分析的成分。三七皂甙的分析時(shí)間一般是 60 多分鐘。隨著對(duì)中藥的研究越來越深入，科學(xué)家們認(rèn)為只控制1到2個(gè)成分還不足以確定中藥的質(zhì)量，必須開發(fā)分離更多組分的質(zhì)量控制方法。像中藥這種復(fù)雜樣品的分離比合成藥物的分離需要更長(zhǎng)的分析時(shí)間。當(dāng)需要考慮樣品通量問題時(shí)，理想的解決方案就是在較短的分析時(shí)間內(nèi)達(dá)到相似或更高的性能。使用RRLC有可能開發(fā)出分析時(shí)間更短、性能更好，又節(jié)省溶劑的方法。對(duì)于生產(chǎn)質(zhì)量控制來說，使用RRLC意味著產(chǎn)品批次的檢定出廠可以比使用常規(guī)HPLC方法更快。

實(shí)驗(yàn)儀器用于開發(fā) RRLC 方法的 Agilent1200系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)包含以下組件：Agilent 1200系列 RRLC系統(tǒng)包括：• Agilent 1200 系列SL型二元泵，帶真空脫氣機(jī)• Agilent 1200系列SL型高性能自動(dòng)進(jìn)樣器• Agilent 1200 系列SL型柱溫箱• Agilent 1200 系列SL型二極管陣列檢測(cè)器，配置微量流通池(2 µL體積，3 mm光程)• Agilent 化學(xué)工作站 B.02.01SR1，用于數(shù)據(jù)采集和分析• Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色譜柱，4.6 x 50 mm, 1.8 µm粒徑常規(guī)HPLC為標(biāo)準(zhǔn)配置Agilent 1100系列液相色譜，包含以下組件：• Agilent 1100 系列二元泵，帶脫氣機(jī)• Agilent 1100 系列自動(dòng)進(jìn)樣器• Agilent 1100 系列柱溫箱• Agilent 1100 系列二極管陣列檢測(cè)器• Agilent ZORBAX SB C18色譜柱，4.6 x 50 mm, 5 µm粒徑

 三七皂甙 R1、人參皂甙Rg1和人參皂甙Rb1標(biāo)準(zhǔn)品購自中國(guó)國(guó)家藥品與生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Re和人參皂甙Rc標(biāo)準(zhǔn)品購自美國(guó)SigmaAldrich公司。• 三七莖葉提取物(NCLE)由用戶實(shí)驗(yàn)室提供。莖和葉用60%乙醇提取，溶劑蒸干后殘?jiān)谜〈既芙?，再將溶劑揮發(fā)掉，殘留黃色粉末用甲醇溶解，待進(jìn)樣。3• 三七根提取物（NRE）由用戶實(shí)驗(yàn)室提供。粗品用水提取，用大孔濾膜過濾，濾液揮發(fā)至干。殘留白色粉末狀物質(zhì)用甲醇溶解，待進(jìn)樣。• 三七購自當(dāng)?shù)匾患宜幉纳痰辏ㄆ放茷橥侍茫４制酚盟?甲醇(30/70, v/v)超聲萃取30分鐘，用0.22微米濾膜過濾，用澄清的濾液進(jìn)樣。• 水、乙腈和甲醇均購自美國(guó)Fisher公司。

方法轉(zhuǎn)換需要將使用填充5 µm填料色譜柱的常規(guī)HPLC方法轉(zhuǎn)換成使用填充1.8 µm填料色譜柱的RRLC方法。使用安捷倫方法轉(zhuǎn)換計(jì)算器( 可用光盤，Agilent 1200系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，發(fā)行號(hào)5989-5130EN)，可使這一過程簡(jiǎn)便、快速(圖1)。方法轉(zhuǎn)換計(jì)算器上列出了各種不同參數(shù)，可以根據(jù)具體需求對(duì)轉(zhuǎn)換后的方法進(jìn)一步改進(jìn)。如需了解如何將一個(gè)常規(guī)HPLC方法手動(dòng)轉(zhuǎn)換成RRLC方法，請(qǐng)參閱安捷倫相關(guān)應(yīng)用報(bào)告2,3,4。

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結(jié)果與討論色譜圖藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，三七植物的不同部位因所含的成分不同具有不同的藥效。使用特殊的提取方法以達(dá)到獲得更多有效成分的目的。用常規(guī)HPLC方法和RRLC方法分析三七樣品得到不同的峰輪廓。圖2顯示了用常規(guī)HPLC方法分析三七莖和葉提取物(NCLE)得到的色譜圖。這種分析通常需要60多分鐘5。如實(shí)驗(yàn)部分所述，用于分析三七樣品的RRLC方法是在常規(guī)HPLC方法的基礎(chǔ)上開發(fā)的。用常規(guī)HPLC方法和 RRLC 方法分析了相同的NCLE樣品。色譜圖見圖2和圖3。圖 3 中的色譜峰比圖 2 中的更窄。這意味著分離復(fù)雜樣品的峰容量增加了。RRLC分析的分離度或分離性能優(yōu)于常規(guī)HPLC。同時(shí)，分析時(shí)間從60分鐘明顯縮短到20分鐘。另一個(gè)要考慮的因素是常規(guī)HPLC和 RRLC 柱的選擇性應(yīng)保持一致。如果新的RRLC柱與常規(guī)HPLC柱相比具有不同的選擇性，方法轉(zhuǎn)換將失去意義。在本研究中，峰輪廓和洗脫順序都相同，所以不需要再對(duì)新色譜圖中的峰進(jìn)行鑒定。而且，二極管陣列檢測(cè)器得到的UV 光譜圖將有助于進(jìn)一步對(duì)色譜峰進(jìn)行確證。