摘要蛻化類固醇(Ecdysteroids)，是存在于無脊椎動物和植物中的甾體激素，它可能被用于飼料中的蛋白同化制劑。蛻化類固醇的濫用控制依賴于生物基質(zhì)樣品中微量（µg.L-1）激素有效檢測方法的建立。本文介紹了雙固相萃取柱(C18 和 SiOH)前處理和液相/電噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)測定尿樣中 20-羥基-蛻化素及代謝物的分析方法。串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度和特定性特別適合內(nèi)標(biāo)樣品和陽性樣品中的痕量激素成份。所有被檢測的化合物，在 0.12 ng至 12 ng 柱上量范圍內(nèi)，具有良好的線性。

前言蛻化類固醇(Ecdysteroids)，是存在于無脊椎動物（主要是節(jié)肢動物）和植物（菊科植物，石竹科及水龍骨科）中的甾體激素。對于菊科植物，蛻化類固醇的作用是脫毛，而這些分子被認(rèn)為是保護(hù)植物防止非適應(yīng)性的食素昆蟲的侵襲。原型蛻化類固醇是 20-羥基蛻化素。幾項(xiàng)表明它對動物（鼠、貓和日本鵪鶉）包括禽畜和人具有促生長作用[1-3]。臨床研究表明 20-羥基-蛻化素比美雄酮（methandrostanolone ）具有更強(qiáng)的蛋白同化作用，而且傳統(tǒng)激素的雄化或其它副作用[4]。然而，盡管它們具有生長促進(jìn)作用，但是只有少數(shù)的方法用于生物樣品中 20-羥基-蛻化素的檢測，而且對于其代謝物在禽畜中的有關(guān)信息沒有報(bào)道[5]。在本應(yīng)用中，建立了一種可以定性和定量牛尿中痕量水平(ppb)20-羥基-蛻化素及代謝物的分析方法[6]。此方法可以用于牛服用 20-羥基-蛻化素之后，在牛尿樣品中 20-羥基-蛻化素的含量及藥物在體內(nèi)去除的動力學(xué)的研究。

實(shí)驗(yàn)部分Compound Standards22S-23S-高油菜素內(nèi)酯（屬于油菜素類固醇，一種蔬菜類固醇），購自 Sigma-Aldrich；20-羥基蛻化素、14-去羥基、20-羥基蛻化素、20，26-二羥基蛻化素來自 Lafont 教授的友好支持。樣品前處理25 毫克的 22S，23S-高油菜素內(nèi)酯作為內(nèi)標(biāo)物（IS），加入到牛尿樣品中，在 3500 轉(zhuǎn)下離心 15 分鐘，然后用 C18 固相萃取柱凈化。固相萃取柱分別用 10 毫升甲醇、10 毫升水活化，然后上樣。分別用 6 毫升水/甲醇（80/20）淋洗固相萃取柱，蛻化類固醇用10 毫升甲醇被洗脫出來。被收集的洗脫液在氮?dú)饬飨麓蹈伞Ｓ?0 微升乙醇和 150 微升環(huán)己烷溶解。然后用 SiOH 固相萃取柱進(jìn)行進(jìn)一步凈化（之前用 25 毫升環(huán)己烷活化）。用 6 毫升乙酸乙酯/環(huán)己烷（80/20），目標(biāo)化合物用 10 毫升氯仿/甲醇/丙酮（6/2/1）洗脫出來。洗脫液用氮?dú)獯蹈?，再溶?50 微升甲醇/0.5% 醋酸水溶液（30/70）。10 微升樣品進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀。

儀器液相色譜：色譜柱： GEMINI C18, Phenomenex(3 µm, 110 ?, 50 × 2 mm)/Agilentequivalent: ZORBAX Extend-C18 3.5 µm,2.1 mm × 50 mm (p/n 735700-902)柱溫： 40 °C流動相： A: MeOHB: 0.5% 醋酸水溶液流速： 0.3 mL/min梯度： Time (min) %B0 908 010 012 9016 90進(jìn)樣量： 10 µL質(zhì)譜： G 6410A QQQ, Agilent Technologies離子化模式： ESI (+)碰撞電壓： 120 V質(zhì)量范圍： 100–500 amu駐留時間： 300 ms毛細(xì)管電壓： 4000 V霧化器壓力： 35 psi干燥氣流速： 11 L/min干燥氣溫度： 325 °C每個目標(biāo)化合物的多反應(yīng)參數(shù)見表 1。第一個離子是響應(yīng)強(qiáng)的離子。

?

為了評價方法的特定性，空白尿樣添加 1 µg.L-1 的 20-羥基蛻化素。圖 2 顯示了空白樣品的分析結(jié)果，在 20E 的位置沒有任何干擾峰，表明分析方法具有優(yōu)異的選擇性。使用多反應(yīng)監(jiān)測模式分析添加20-羥基蛻化素的樣品。結(jié)果表明本方法具有優(yōu)異的靈敏度和很好的信噪比。分析結(jié)果滿足歐盟 2002/657 的要求，此歐盟要求要求更多的鑒定點(diǎn)以提高確定度[7]。利用添加五個不同濃度（0.2 ng.mL-1、0.5 ng.mL-1、1 ng.mL-1、5 ng.mL-1 和 20 ng.mL-1)的尿樣進(jìn)行線性和重現(xiàn)性的評價。校正曲線的線性回歸系數(shù)優(yōu)于(R2)0.99，結(jié)果顯示 20-羥基蛻化素具有優(yōu)異的線性。本方法成功地用于牛在服用 20-羥基蛻化素之后的尿中的激素的濃度水平，一共分析了四天的樣品。在服藥 30 分鐘之后就檢測到尿中含有 20-羥基蛻皮酮，而且濃度水平在 24 小時內(nèi)持續(xù)上升。20-羥基蛻化素有兩個代謝物，分別是 14-去羥基、20 羥基蛻皮酮(M1)和 20，26-二羥基蛻皮酮(M2)[8]。表 1 中是 LC/MS/MS 分析兩個代謝物的參數(shù)。圖 3 是 14-去羥基、20 羥基蛻皮酮(M1)在服藥之前和兩天之后的尿樣的分析結(jié)果。結(jié)果表明，服藥之前沒有檢測出 M1，服藥之后的四天還可以檢測出 M1。根據(jù)四個鑒定點(diǎn)的分析原則，在服藥兩天之后，還依然可以檢測 M1。由于在服藥后可以長期檢測出 M1，因此可以監(jiān)測蛻化類固醇的誤用或?yàn)E用。

結(jié)論本方法的分析結(jié)果表明液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)是能夠有效驗(yàn)證尿樣中 20-羥基蛻化素及兩個代謝物。這些化合物可以被用于動物是否發(fā)生 20-羥基蛻化素的誤用或?yàn)E用的監(jiān)測和控制。串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀的多反應(yīng)監(jiān)測功能大大提高化合物的定量和確認(rèn)可信度，滿足歐盟 2002/657/EC 決議的規(guī)定。牛尿樣品的成功檢測建立了可靠的分析操作流程。本方法學(xué)也可以用于牛尿中20-羥基蛻化素主要代謝物的一級消除動力學(xué)研究。