引言中藥在中國的應(yīng)用已有數(shù)千年歷史 ，在中國和其他國家顯示了非常好的治療效果 。與以往相比 ，越來越多的中藥材在農(nóng)場中進行大規(guī)模的栽培 。農(nóng)場使用的殺蟲劑應(yīng)得到監(jiān)測 ，以確保其殘留量在安全范圍內(nèi) 。中藥的基質(zhì)非常復(fù)雜 ，并且常用的殺蟲劑有好幾百種 ，但是其殘留量卻非常小 。由于這些因素的存在 ，在短時間內(nèi)完成殘留殺蟲劑的篩選成為非常困難的一項任務(wù) 。這一問題的解決涉及以下幾個步驟 ，包括樣品預(yù)處理 、儀器采集 、數(shù)據(jù)處理和報告生成 。使用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）的基本要求如下 ：1. 有效而且簡單的樣品制備方法2. 重復(fù)性好而且可重現(xiàn)的保留時間3. 包含保留時間和質(zhì)譜信息的數(shù)據(jù)庫QuEChERS 是由 Dr. Steven J. Lehotay 和他的同事們開發(fā)的一種食品中殺蟲劑分析方法 ，由 Quick（快速 ）、Easy（簡便 ）、Cheap（經(jīng)濟 ）、Effective（有效 ）、Rugged（穩(wěn)定 ）和 Safe（安全 ）的首字母縮寫而命名[1-5]。這里之所以選擇 QuEChERS，是因為和傳統(tǒng)方法相比 ，它具有很多優(yōu)點 ，例如對于極性和揮發(fā)性不同的殺蟲劑有高回收率 ，樣品通量大 ，有機溶劑用量小 ，不使用氯化物作溶劑[1-5]。QuEChERS 滿足上述第 1 條基本要求 。保留時間鎖定（ RTL） [6]指在不同的 Agilent6890/7890 GC 系統(tǒng)中使用相同牌號色譜柱 ，仍然獲得非常接近的色譜保留時間的能力 。Agilent 7890GC 的保留時間重復(fù)性尤其出色 ，偏差小于 0.01 分鐘 。RTL 能夠使不同儀器的保留時間精確地匹配 ，滿足上述第 2 條基本要求 。

 

2005 年 11 月 29 日 ，日本厚生?。∕HLW）頒布了一套有關(guān)殺蟲劑 、飼料添加劑和獸藥管理的“肯定列表（Positive List）”制度 。該制度是世界上有關(guān)殺蟲劑嚴厲的法規(guī) 。按照該法規(guī) ，安捷倫開發(fā)了一種新型數(shù)據(jù)庫 ，名為“日本肯定列表保留時間鎖定數(shù)據(jù)庫（the Japanese Positive List RTLDatabase）”，其中包括了日本肯定列表中所有適用于氣相色譜分析的殺蟲劑 ，以及日本檢疫機構(gòu)監(jiān)測的其它殺蟲劑 。該數(shù)據(jù)庫中包含各種殺蟲劑的保留時間和光譜信息 ，因此滿足上述第 3 條基本要求[7]。另外 ，篩選方法還應(yīng)滿足以低的假陽性和假陰性率對殺蟲劑進行快速確認的要求 。安捷倫解卷積報告軟件（DRS）[7]設(shè)計用于從基質(zhì)中對質(zhì)譜進行自動解卷積 ，從而生成定性和定量報告 。 DRS 整 合 來 自 三 個 方 面 的信息 ： MSDChemStation、 自 動 質(zhì)譜解 卷 積 和 鑒 定系統(tǒng)（AMDIS），以及美國標準與技術(shù)研究院（NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索 。DRS 增強了從復(fù)雜基質(zhì)中獲得結(jié)果的信心 ，一般的數(shù)據(jù)處理時間只需 2～3 分鐘 ，很好地滿足了以上所提的更高要求 。本文闡述了如何應(yīng)用以上技術(shù)手段來開發(fā)中藥基質(zhì)中殺蟲劑篩選的一整套方法 。研究的目標包括中藥的不同藥用部位 ，如金銀花的花 、黃芪的根和莖 、銀杏葉的葉 、人參的根和枸杞的果實 。通過約 20 分鐘的 QuEChERS 預(yù)處理 ，所得提取物注入 Agilent7890A/5975C。運行日本肯定清單測試方法 ，并采用反吹技術(shù) ，運行時間約 37 分鐘 。最后 ，利用日本肯定清單 RTL 數(shù)據(jù)庫 ，經(jīng)過 2～3 分鐘的 DRS 處理 ，自動生成一份定性定量報告 。

 

實驗部分中藥材購自當?shù)厮幍?，包括金銀花 、黃芪 、銀杏葉 、人參和枸杞 。所有樣品均研成細粉 。樣品制備• 稱取中藥材細粉 1 g，置 50 mL 聚四氟乙烯試管中 ，加入蒸餾水 6 mL，使樣品潤濕 ，并于室溫中存放 2 小時• 加入 0.1%的冰醋酸乙腈溶液 4 mL，用手劇烈振搖1 分鐘 ，然后加入硫酸鎂 1.2 g、氯化鈉 4 g，繼續(xù)用手劇烈振搖 1 分鐘后 ，以 4000 rpm 轉(zhuǎn)速離心 3 分鐘• 取 PSA（部件號 5188-5364）500 mg、C18（部件號 189-1302）250 mg、硫酸鎂 250 mg，置5 mL 離心管中 ，接著移取上述提取液的上清液1.5 mL 至離心管中 ，以 3000 rpm 轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘 。如果離心后溶液呈黑色 ，可加入石墨化碳黑以吸附其中的色素（如葉綠素 ）• 移取提取液 1.0 mL 至 GC 樣品瓶中如果在篩選后還需要進行專屬的定量分析 ，可在最終溶液中加入分析保護劑和內(nèi)標物質(zhì) 。GC/MS日本肯定清單方法由日本厚生省發(fā)布 ，用于所有日本生產(chǎn)和進口的農(nóng)產(chǎn)品中殺蟲劑的檢測 。本文中 ，對該方法進行改進 ，加上反吹過程 ，用以處理復(fù)雜的中藥基質(zhì) 。方法參數(shù)詳見表 1。系統(tǒng)的軟件要求Agilent MSD ChemStation (部件號 G1701EA, Ver.E.02.00)、安捷倫解卷積報告軟件(部件號 G1716AA,Ver. A.04.00)、 NIST05b 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 (部 件 號G1033A)，包括 NIST MS Search (Ver. 2.0d) 和AMDIS (Ver. 2.65)，以及安捷倫日本肯定列表殺蟲劑RTL 數(shù)據(jù)庫 (部件號 G1675AA)。

 

結(jié)果與討論用于多種中藥基質(zhì)的 QuEChERS 方法優(yōu)化在中藥制劑中 ，可以選擇中藥材不同的可食用部位入藥 。另外 ，中藥基質(zhì)的化學(xué)成分復(fù)雜 ，含有皂苷 、多糖 、黃酮 、酚酸以及脂肪酸等 。因此 ，測定如此復(fù)雜的中藥基質(zhì)中的殘留殺蟲劑是一項艱巨的任務(wù) 。本次研究中 ，首先對金銀花進行了考察 ，隨后 ，為了在化學(xué)成分方面更具代表性 ，將不同的中藥混合在一起 。選擇了 5 種中藥材進行混合 ，分別是金銀花 、黃芪（根和莖 ）、銀杏葉 、人參（根 ）和枸杞子 。

QuEChERS 方法中 ，吸附劑的用量對于殺蟲劑的回收率有很大的影響 。已經(jīng)證明 ，PSA 在處理中藥提取物的酸性成分方面更為有效 。通過對 PSA 不同劑量的篩選發(fā)現(xiàn) ， 500 g 的用量已經(jīng)足夠 。經(jīng)QuEChERS 處理的混合中藥樣品典型色譜圖見圖 1。

 

微板流路控制技術(shù)產(chǎn)生的反吹作用在復(fù)雜的中藥基質(zhì)分析研究中的應(yīng)用反吹作用通過改變色譜柱中載氣流的方向 ，將高沸點物從色譜柱入口端沖出 。經(jīng)證明 ，這種反吹作用能夠有效地消除一次次運行產(chǎn)生的化學(xué)噪聲 。通常 ，高沸點物留在色譜柱的前端 ，只有將柱溫升至足夠高 ，才能把它們趕出色譜柱 。長時間高溫烘烤色譜柱易使色譜柱填料嚴重流失 ，導(dǎo)致色譜柱壽命縮短 。有些復(fù)雜基質(zhì) ，即使長時間烘烤仍然無法除去高沸點物 ，則可能在下一次進樣時發(fā)生保留時間漂移 。反吹是避免高溫烘烤和保留時間漂移的最高解決方案 。反吹能程度地減小對檢測器的污染 ，這對于質(zhì)譜檢測器尤為重要 ，因為它可以減少離子源的清洗次數(shù) 。反吹的另一個積極貢獻在于它能縮短運行周期 ，從而提高實驗室的效率 。有關(guān)反吹作用的詳情 ，包括方法開發(fā)步驟 ，可參見安捷倫相應(yīng)的應(yīng)用報告[8]。本實驗中 ，使用帶尾吹氣的三通分流器來實現(xiàn)反吹作用 。該裝置有特別的尾吹氣補充管路和四個接口 ，一個接色譜柱 ，另三個可與三個不同檢測器的限流管相連 。由于本次研究中僅用到一個質(zhì)譜檢測器 ，尾吹氣前兩個接口被封上 ，第三個接口連接色譜柱 ，最后一個接口連接限流管 。這樣設(shè)置的主要目的是避免由于死體積的增大而引起色譜峰展寬 。限流管的長度和內(nèi)徑分別為 0.706 m 和 0.18 mm。該裝置和 GC/MSD 系統(tǒng)設(shè)置示意圖見圖 2。中藥基質(zhì)中目標殺蟲劑的 DRS 鑒定殺蟲劑分析的另一個挑戰(zhàn) ，是在復(fù)雜的基質(zhì)中對痕量的目標化合物進行鑒定時 ，通常受到很高的化學(xué)噪音的干擾 ，得到的譜圖庫匹配因子很低 。為改善匹配因子 ，以前常用的方法是背景扣除 ，然而 ，這種方法同時受到基質(zhì)情況和檢測人員水平的影響 ，有時會給出不一致的結(jié)果 。

安 捷 倫 于 2004 年 投 入 應(yīng)用的解 卷 積 報 告 軟 件（DRS）是一個軟件包 ，將三個不同數(shù)據(jù)處理軟件信息整合成易于閱讀的報告 。DRS 的最主要優(yōu)點是大大縮短了從復(fù)雜的基質(zhì)分析中解讀結(jié)果所需的時間 。然而 ，一個合適的數(shù)據(jù)庫對于成功運用 DRS 非常重要 。日本肯定清單 RTL 數(shù)據(jù)庫是用于殺蟲劑分析的新型 DRS 數(shù)據(jù)庫 ，包含 430 種適用氣相色譜分析的殺蟲劑的保留時間和質(zhì)譜信息 。數(shù)據(jù)庫的詳細信息參見安捷倫的應(yīng)用報告[7]。中藥基質(zhì)中殘留殺蟲劑分析的數(shù)據(jù)處理和報告生成 ，優(yōu)先推薦使用 DRS 與日本肯定列表 RTL 數(shù)據(jù)庫 。圖 3 是加標混合中藥樣品的典型 DRS 報告的一部分 。圖 4 顯示了分析中藥基質(zhì)殘留殺蟲劑時使用 DRS 的優(yōu)勢 。在混合中藥樣品中加入 10 ppb 濃度水平的甲基嘧啶磷 。該化合物被 MSD ChemStation 漏過了 ，卻由 DRS 成功檢出 。上方窗口是總離子色譜圖（TIC），中間窗口是第 2199 次掃描（13.981 分鐘 ）時有干擾的原始光譜 ，下方窗口是解卷積光譜（白色曲線 ）和日本肯定列表清單 RTL 數(shù)據(jù)庫中甲基嘧啶磷光譜（黑色曲線 ）的對比 。經(jīng)過解卷積 ，第 2199 次掃描的光譜圖變“干凈”了 ，從而能從混合中藥樣品中輕松鑒定出甲基嘧啶磷 。

 

結(jié)論痕量水平殺蟲劑分析最主要的干擾就是復(fù)雜中藥基質(zhì)中的化學(xué)噪聲 。本文采用了幾種新技術(shù)以消除這些干擾 。成熟的樣品制備方法是盡可能地去除化學(xué)噪聲的主要途徑 。應(yīng)用 QuEChERS 方法使樣品制備步驟得到了簡化 ，提高了實驗室的效率 ，整個處理過程僅需 20 分鐘左右即可完成 。然而 ，即使應(yīng)用了有如 QuEChERS 這樣的預(yù)處理方法 ，仍然不能除去化學(xué)噪聲 。反吹是另一種可以消除一次次運行中化學(xué)噪聲的方法 。盡管反吹不是一個新的概念 ，但是應(yīng)用微板流路技術(shù)能夠比以往更有效地實現(xiàn)反吹作用 。本研究中 ，一種帶尾吹氣的三通分流器用于實施反吹作用 ，帶反吹的數(shù)據(jù)采集時間約為 37 分鐘 。在數(shù)據(jù)處理過程中與化學(xué)噪聲有關(guān)的最后一步利用了一種解卷積的算法 。安捷倫的解卷積報告軟件能夠?qū)?shù)據(jù)處理時間縮短至 2～3 分鐘 ，同時應(yīng)用了日本肯定清單 RTL 數(shù)據(jù)庫 ，對于中藥基質(zhì)中殺蟲劑的分析十分有效 。從樣品預(yù)處理到生成篩選報告 ，整個中藥基質(zhì)中 430 種殘留殺蟲劑的篩選僅需 1 小時即可完成 。